2014 Fiscal Year Annual Research Report
細菌膜蛋白質複合体の分子配列メカニズムに関する光学・電子顕微鏡複合解析
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24657108
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| Research Institution | Hosei University |
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Principal Investigator |
川岸 郁朗 法政大学, 生命科学部, 教授 (80234037)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 一則 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域 バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (40356837)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / 細胞膜 / 膜蛋白質 / 蛍光顕微鏡 / 電子顕微鏡 / 凍結割断レプリカ法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌内膜で巨大クラスターを形成する走化性受容体，内膜と外膜を貫く異物排出トランスポーター複合体に焦点を当て，以下の解析を行った．
１．走化性受容体の局在・膜内動態：まず，走化性受容体TarとGFPの融合蛋白質を染色体上から発現する菌株を用いて，受容体の局在・膜内動態およびそれに対するChe蛋白質の影響を解析した．その結果，受容体が内膜の細胞側面領域に挿入された後，徐々に大きなクラスターを形成し，極へと移行することが示唆された．ただし，この段階のどこでCheW, CheAと複合体を形成するのかに関しては今後の検討が必要である．さらに，前年度までに確立した手法を応用し，TCタグ融合コレラ菌CheAホモログをFlAsH標識し，エネルギー代謝低下時にのみ極に局在することを立証した．一方，GFP標識受容体を用いてDAB標識法の確立を目指したが，まだ成功には至っていない．
２．部位特異的架橋形成による受容体クラスターの解析：全走化性受容体遺伝子欠失株にCys置換変異受容体TarとTsrを発現させ，Tar-Tsr間架橋形成を検出する系を確立した．この結果，異種受容体混合クラスターの構造を推定し，リガンド存在下での変化を追跡することが可能になった．
３．走化性受容体の細胞膜内クラスターの解析：Tar, Tar-GFP, Tar-TCを全受容体遺伝子欠失大腸菌株に発現させ，凍結割断レプリカ法により内膜の微細形態を観察した．より詳細な解析の結果，Tarの局在場所と無粒子領域には直接の相関が見られなかった．今後はTarを標識する方法を確立しつつ，無粒子領域の実体も明らかにする必要がある．
４．異物排出トランスポーター複合体：内膜と外膜を貫く構造体として異物排出トランスポーターと外膜チャネルTolCの複合体の検出を試みた．具体的には，野生株とtolC欠失株を用いて凍結割断レプリカ法による観察を行った．
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