2013 Fiscal Year Research-status Report
うま味受容体Ｔ１Ｒ１・Ｔ１Ｒ３の分子間およびドメイン間相互作用解析
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24657120
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| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
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Principal Investigator |
海老原 充 石川県立大学, 生物資源環境学部, 准教授 (80232974)
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| Keywords | トリプレットリピート / ポリロイシン / 相互作用 / GPCR / うま味受容体 |
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| Research Abstract |
近年、受容体は細胞外ドメインや細胞内ドメインなどで相互作用することで膜移行が促進されたり、ヘテロダイマー形成が行われたりすることが明らかになってきている。本研究では、これまで相互作用領域が報告されていないうま味受容体T1R1・T1R3を研究対象とし、そのヘテロダイマー形成がどのようにして行われているかを解明することを目的としている。
そこで、本研究では、T1R1・T1R3相互作用領域を解明するために、個々のドメインを発現するドメインライブラリーを作成してきた。
25年度は、ドメインライブラリーの有効性を検証するために、うま味受容体T1R1およびT1R3（7回膜貫通型GPCR）の個々の膜貫通ドメインではなく、すべての膜貫通ドメインを含む領域をクローニングし、それらをGatewayクローニング法により、発現ベクターpcDNA6.2/v5-DESTへと組み込んだ。また、これらのライブラリーに加えて、相互作用の主役を担うと考えられるポリロイシン領域を、様々なほ乳類から単離し、これらもポリロイシンライブラリーとして発現ベクターに導入した。両ライブラリーとも、split GFP法によるアッセイが可能となるよう、GFPのN末側およびC末側を連結させた。さらに、膜移行が行われるように、これらのクローンのN末側にはシグナル配列を連結させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ポリロイシンライブラリーおよび昨年度作成したドメインライブラリーがほぼ作成でき、最終年度である26年度には、ドメイン間の相互作用を検定する準備が整った。これらのエントリークローン組み合わせて、発現ベクターpcDNA6.2/v5-DESTにクローニングすることにより、最終的なポリロイシンおよびドメインライブラリーが完成する。本来は、25年度中に作成に着手する予定であったポリロイシンライブラリーの調製が遅れたため、80％の到達度と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、発現ベクターへのクローニングを行い、発現用ドメインおよびポリロイシンライブラリー完成させるとともに、それらを用いたsplit GFPアッセイを行う。また、この相互作用アッセイが可能となれば、他の膜タンパク質間相互作用のアッセイも可能となることから、甘味や苦味受容体の相互作用領域を決定するための、網羅的ドメインライブラリーの作製を視野に入れる。
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