2012 Fiscal Year Research-status Report
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24658005
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
村田 稔 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20166292)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 相同組み換え / ターゲッティング / Cre/LoxP / GFP / シロイヌナズナ |
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| Research Abstract |
本研究では、植物ではこれまで低頻度でしか起こらなかった相同組換えを高頻度で誘発し、効率的な遺伝子ターゲッティング法の確立を目的としている。そのため、本研究ではまずシロイヌナズナを材料に、二種類のコンストラクトを作成した。一つは、ターゲッティングコンストラクトで、バイナリーベクターのボーダー配列内に２つのLoxPを配置し、その間にクローニングサイト（CS）を組み込んでおき、ターゲットとするゲノム配列や特定遺伝子を挿入できるようにしたものである。これには、マーカー遺伝子としてGFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子を、CaMV35Sプロモーターと切り離して配置し、LoxP間の組換えにより、GFPが発現するよう工夫した。二つめは、Creリコンビナーゼの過剰発現コンストラクトであり、核移行シグナルを含むCre遺伝子はCaMVの35SプロモーターとΩ要素にドライブされ過剰に発現するようデザインした。これらのコンストラクトをFAST法によりシロイヌナズナの実生に共感染させ、Creリコンビナーゼによって、GFPが一過的に発現するかを調べた。その結果、子葉の一部にGFPのシグナルが観察され、LoxP間の組換えが誘発されたことが示唆された。しかしこの場合、T-DNAが縦列して染色体に挿入されたことも考えられたため、PCRにより、この領域を増幅し、塩基配列を調べたところ、LoxP間の組換えが誘発されていることが明らかとなった。組換えを起こしたT-DNAが子葉細胞内でどのような挙動を取っているかについては、現在調査中であるが、環状化し核内にとどまっていることも推定される。現在は、縦列型の反復配列をコンストラクトにクローニングし、同様の実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画されたコンストラクトが作成され、これを用いた研究が進展しているため
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| Strategy for Future Research Activity |
コンストラクトの有効性を探るため、シロイヌナズナの一過的な発現系（FAST）を利用しているが、データにややバラツキが生じる難点がある。より安定な系を確立する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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