2014 Fiscal Year Annual Research Report
ジーンターゲッティングによる汎用的点変異導入システムの開発
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24658011
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| Research Institution | National Institute of Agrobiological Sciences |
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Principal Investigator |
雑賀 啓明 独立行政法人農業生物資源研究所, 農業生物先端ゲノム研究センター ゲノム機能改変研究ユニット, 主任研究員 (20435613)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ジーンターゲッティング / 変異導入 / マーカー除去 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したジーンターゲッティング（GT）は、標的遺伝子を狙って改変することが可能な汎用的遺伝子組換え技術である。この方法では、標的遺伝子内やその近傍に、ポジティブ選抜マーカー発現カセットと目的の小さな変異を同時に導入することができる。さらに、GTに利用したポジティブ選抜マーカーを足跡を残さずに除去することで、標的遺伝子に目的の変異だけを残すことが可能である。そこで、本研究では、DNA二重鎖切断修復の1つである単鎖アニーリング（SSA）を利用したマーカー除去システムに着目し、その高度化を目的とした。
これまでに、SSAが生じた細胞に除草剤耐性を付与するためのマーカーコンストラクトAL-LSを構築した。このコンストラクトを、SSAイベントを可視化することができるGU-USコンストラクト、及び薬剤誘導的にDNA二重鎖切断を誘導するための制限酵素発現コンストラクトを有するイネに形質転換した。得られたT1種子からカルスを誘導し、薬剤処理によって制限酵素の発現を誘導した。その結果、コントロールカルスからは除草剤耐性カルスをクローン化することができなかったのに対し、薬剤処理を施したカルスからは除草剤耐性カルスを得ることができた。さらに、除草剤耐性を示したカルスについてサザンブロット解析を行った結果、AL-LS、GU-USいずれのマーカーにおいても、SSAによって修復されたことを示すバンドが検出された。以上の結果から、AL-LSマーカーを利用することで、AL-LSマーカーと、それとは異なる位置に座乗するGU-USがともにSSAによって修復された細胞を効率よく濃縮できることが示された。
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