2012 Fiscal Year Research-status Report
病原体認識機構に基づく新規植物病害抵抗性遺伝子探索法の開発
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24658044
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
小林 括平 愛媛大学, 農学部, 准教授 (40244587)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 植物 / ウイルス / 抵抗性遺伝子 / タンパク質間相互作用 / 酵母ツーハイブリッド法 |
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| Research Abstract |
これまで、植物の病害抵抗性遺伝子は植物体への接種試験によって発見され、その単離はポジショナルクローニング法によることが多く、膨大な時間と労力を要していた。近年、既知の抵抗性遺伝子の塩基配列情報を利用した抵抗性遺伝子探索法も利用されるようになったが、我々のこれまでの研究から、この方法も必ずしも遺伝子単離に結びつかないことが分かった。そこで、我々は抵抗性遺伝子がコードしている抵抗性タンパク質が病原体を認識するメカニズムを利用して、新たな抵抗性遺伝子を探索する方法を考案した。抵抗性タンパク質が病原体タンパク質を認識する際、それぞれが直接相互作用するだけでなく、第三のタンパク質因子（共役因子）を含むタンパク質複合体を形成すると考えられている。我々はこれまでにトウガラシのトバモウイルス抵抗性に関わるL抵抗性タンパク質の共役因子、LIPM1およびLIPM2を酵母ツーハイブリッド（Y2H）法によって単離した。本研究は、これら共役因子との相互作用を利用して新規の抵抗性遺伝子を探索する方法を確立することを目的とした。今年度はまず、抵抗性タンパク質のN末端領域をY2H用のDNA結合ドメインのN末端側に融合させる形でcDNAライブラリーを作製する方法を確立した。そして、トウガラシおよびL抵抗性タンパク質と同様にトバモウイルスの外被タンパク質を認識する抵抗性遺伝子を持つことに知られるナスにおいて、同法によって多様なcDNAをクローニングすることができることを見出した。さらにそれらのライブラリーからLIPM1および／またはLIPM2と相互作用するcDNAクローンをY2Hによって選抜することが可能であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の当初計画では、LIPM1およびLIPM2を用いてL抵抗性タンパク質をトウガラシのcDNAライブラリーから単離する条件を検討する計画であった。しかし、L抵抗性タンパク質のCCドメインにおいてLIPM1およびLIPM2との相互作用に与る領域を同定し、N末端部位は相互作用に関与しないことが明らかとなった。それゆえN末端配列の多様性を無視し、共通プライマーを用いてcDNAを合成することが可能となった。そこで予定を前倒しし、ナスのcDNAライブラリーも並行して解析することとした。これまでにトウガラシおよびナスのcDNAライブラリーから、LIPM1およびLIPM2のいずれを用いた場合にもこれらと相互作用するクローンが多数得られることを明らかにした。すなわち、ナスの候補クローンが得られているという点では計画を上回る成果が得られている。しかし一方で、トウガラシで予定していたスクリーニング条件の検討を後回しにしたことから、全体としてはほぼ計画通りの達成度と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のようにすでにナスからLIPM1および／またはLIPM2と相互作用するタンパク質のcDNAクローンが得られており、これらについて塩基配列を決定する。続いてその全長配列を取得する。この目的で3´-および5´-RACE法を行い、抵抗性タンパク質のC末端領域および5´非翻訳領域の塩基配列情報を取得し、その情報を用いて全長配列をPCRで増幅してクローン化する。これについて全塩基配列を決定するとともにNicotiana benthamianaにおける一過性発現系を用いて抵抗性遺伝子としての機能を確認する。植物体への接種試験から、ナスのトバモウイルス抵抗性遺伝子はトマトモザイクウイルス（ToMV）に対する抵抗性を規定することを明らかにしたので、ToMV外被タンパク質との共発現によって過敏感細胞死を誘導するか否かで抵抗性遺伝子であるかどうかを確認することができる。また、この抵抗性遺伝子探索法の汎用性を高める目的で、より多様なcDNAを合成できる方法を用いて抗性遺伝子を探索することができるかどうか明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度はN. benthamianaにおける一過性発現系を用いて抵抗性遺伝子としての機能を解析するため、遺伝子組み換え実験（植物接種実験）を行うための植物インキュベーターを購入する予定である。また、3´-および5´-RACE法、クローニングおよびシークエンス解析に使用する酵素等の消耗品を購入する。また、順調に実験が進んだ場合は年度内に論文発表が可能と考えられ、その掲載料等も本補助金から支出する予定である。
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