2012 Fiscal Year Research-status Report
piggyBac転移酵素の改変による配列特異的遺伝子組換え手法の開発
Project/Area Number |
24658057
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Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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Research Institution | National Institute of Agrobiological Sciences |
Principal Investigator |
小島 桂 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (40370655)
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Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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Keywords | piggyBac |
Research Abstract |
トランスポゾンpiggyBacを用いた、カイコの遺伝子組換え手法の改変として、piggyBac転移酵素に配列特異性を付与する試みとして以下の研究を行なった。まず、カイコで機能することが既知で、特異的DNA配列に結合すると考えられる、2種類のジンクフィンガーDNA結合ドメイン(ZF-DNA-BD)を、piggyBac転移酵素のN末端およびC末端に融合させた人工転移酵素4種の遺伝子を構築した。この際、ZF-DNA-BDとpiggyBac転移酵素との間にはフレキシブルリンカーとして、バネ状の配列(GPGGA)2配列を挿入した。これらの組換えpiggyBac転移酵素を、カイコ培養細胞BmNで発現させるための発現ベクターに組込み、組換え用トランスファーベクターとともに、BmN細胞にコ・トランスフェクションした。組換え用トランスファーベクターとしては、カイコでの実績があるベクターを用いた。トランスフェクションののち、1週間・2週間後にゲノムDNAを抽出し、インバースPCR法により挿入位置近傍の配列を増幅し、解析した。これまでのところ、組換えpiggyBacによる挿入位置の明確な違いは見いだされていない。 今回得られた結果は、ZF-DNA-BDのpiggyBac転移酵素への挿入位置についてN末端に融合させただけでは機能性を発揮させられない可能性を示唆している。今後は、両ドメイン間のスペーサーの長さや、配列についてより広く検討することなど、さらに最適化する必要があると考えられる。 特異的DNA配列を認識するpiggyBac転移酵素の構築が実現されれば、その価値は高く早期の実現を目指す。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目評としていた「piggyBacの転移において、配列特異的な挿入イベントの検出」に至らなかったが、研究は計画通りに遂行した。
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Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画に従って研究を遂行する。
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Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
H26年度は、物品の購入は行なわず、研究費は、H26年度から始めるカイコでの実験のための人件費と、消耗品および成果発表のための旅費に当てる。 消耗品としては、遺伝子組換え実験用器具および試薬(制限酵素等)、カイコ培養細胞の為の培地等、および、カイコ飼育用材料である。 人件費としては、H26年度後半の4ヶ月について、パートを雇用する予定である。
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