2014 Fiscal Year Annual Research Report
土壌中の亜酸化窒素還元酵素群の「活性メタプロテオーム」解析
Project/Area Number |
24658063
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Research Institution | Yamaguchi University |
Principal Investigator |
横山 和平 山口大学, 農学部, 教授 (10230658)
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Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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Keywords | 一酸化二窒素還元酵素 / 二次元電気泳動 / 活性染色 / 土壌 / 脱窒菌 / 一酸化二窒素 |
Outline of Annual Research Achievements |
純粋培養菌体から得たペリプラズムタンパク質画分を、既製ゲルを用いた二次元Native PAGE(等電点電気泳動/Native PAGE)の後、活性染色法に供試しても、活性亜酸化窒素還元酵素(以下、N2OR)のバンドが得られなかった。これは、一次元目用ゲル中のチオ尿素がN2ORを阻害するためであることを見出し、チオ尿素を含まない等電点電気泳動用のゲルを自作した。 一次元目の等電点電気泳動に供試した粗タンパク質は等電点沈殿し、二次元目のNative PAGEゲルに完全には移動せず、特に、中性付近から弱アルカリ性pI領域では顕著だった。等電点電気泳動後の固定・洗浄条件および二次元Native PAGEの泳動条件を種々検討したが、活性染色によるN2ORのスポットは得られなかった。 水田あるいは畑土壌に牛糞堆肥を添加して嫌気条件で培養し、0.1Mピロリン酸ナトリウムで洗浄後、細菌菌体を0.1%DNA含有Tris-EDTA緩衝液で抽出し、ヒスコトロンで破砕して得た抽出液を分子量分画して粗タンパク質溶液を得た。Native PAGE/活性染色に供試したが、活性のあるバンドは得られず、クマシ―染色後もタンパク質スポットは検出されなかった。 最終年度は、等電点電気泳動ゲルからの移動を改善するために、高解像度クリーンNative PAGE及び低濃度SDSの添加を試したところ、一次元目の等電点電気泳動ゲルからの移動は改善されたが、活性スポットは得られなかった。そこで、等電点沈殿を防ぐ等電点電気泳動の条件検討を行ったが、その後のNative PAGEで活性スポットを得ることはできなかった。土壌からのタンパク質抽出条件を改良し、比重分画により微生物菌体画分を得、ビーズビーティングで破砕し、分子量10万から100万の画分をNative PAGEにかけ活性染色したが、明瞭なバンドが得られず、タンパク質を抽出できていないと考えられた。
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Research Products
(2 results)