2012 Fiscal Year Research-status Report
乳酸菌によるペプチド腸管送達系の構築と炎症性腸疾患治療への応用
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24658099
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
見明 史雄 福岡大学, 薬学部, 教授 (50248522)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鹿志毛 信広 福岡大学, 薬学部, 教授 (80185751)
佐藤 朝光 福岡大学, 薬学部, 助教 (90369025)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 乳酸菌 / CTB-YVAD融合体 / 抗炎症作用 / 炎症性腸疾患 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、caspase-1の活性化を阻害するYVAD（チロシン-バリン-アラニン-アスパラギン酸）をCholera Toxin B subunit (CTB)との融合体として分泌する乳酸菌を作出し、炎症性腸疾患 (IBD)の治療薬として応用することにある。平成24年度は、大腸菌と乳酸菌のシャトルベクターpHIL253を作製した後、CTBおよびCTB-YVAD融合タンパク質を分泌するLactobacillus caseiを作出した。L. caseiに分泌させたCTBおよびCTB-YVADは、Vibrio choleraeが産生するCTBと同様に、GM1-gangliosideに結合することを確認した。さらに、CTB-YVADの生理活性を検討するために、培養上清からのCTBおよびCTB-YVADの精製を行った。L. caseiに分泌させたCTB-YVADがGM1-gangliosideに結合したことから、申請者の予測どおり、CTB-YVADは容易にヒトおよびマウス細胞内に侵入し、caspase-1の活性化を阻害できる可能性が高い。したがって、平成24年度の研究により、新たなIBD治療薬となり得る遺伝子組換え乳酸菌を作出することができた。
本研究では、CTB-YVADの抗炎症作用を評価するために、Caco-2細胞においてLPSにより誘発されるcaspase-1の活性化、IL-1bの遊離を指標とする。また、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の自由飲水により誘発されるマウス大腸炎の効果も検討する。平成24年度は、その前段階として、LPSのCaco-2細胞への曝露によりcaspase-1が活性化されることをその酵素活性を測定することで、IL-1bの遊離が増大することをELISA法を用いて確認した。さらに、DSSの投与により大腸炎を発症するマウスの作製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的を達成するためには、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の3項目を実施する必要がある。本年度の研究により、それぞれの項目について、以下の結果を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断した。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」：GM1-gangliosideに対する結合能を有するCTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換えL. caseiを作出した。
「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」：CTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換えL. caseiの培養上清からのCTB-YVADおよびCTBの精製に成功した。また、精製したCTB-YVADの抗炎症作用をin vitroで評価する前段階として、ヒト腸管上皮細胞株Caco-2にLPSを曝露することで、caspase-1の活性およびIL-1bの遊離が増大することを確認した。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」：CTB-YVADを分泌する乳酸菌の治療効果を検討する前段階として、IBDモデルマウスを作製することに成功した。具体的には、6週齢の雄性C57BL/6Nマウスに5%デキストラン硫酸ナトリウムを7日間自由飲水させることで、体重減少、下痢、血便、大腸の短縮、腸管におけるミエロペルオキシダーゼ活性の増大、炎症性サイトカインの発現誘導を観察することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の2項目を実施する。
「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」：Caco-2細胞にLPSおよび精製したCTB-YVAD、CTBを曝露し、caspase-1の活性化、IL-1bの遊離を指標に、in vitroにおける抗炎症作用を評価する。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」：平成24年度の研究成果により作製したIBDモデルマウスに、CTB-YVADを分泌する遺伝子組換えL. caseiを経口投与し、大腸炎が改善されるか検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度の研究費として、消耗品1,950千円を使用する予定である。具体的には、電気泳動やイムノブロッティング等に必要な一般試薬に200千円を、遺伝子組換え等に必要な制限酵素等の酵素類に200千円を、細菌や細胞の培養に必要な培地成分、血清等の培地類に300千円を、イムノブロッティングやELISAに必要な抗体類に300千円を、実験用マウス購入費用に200千円を、実験に必要なマイクロチューブ、チップ、培養器具類などプラスチック器具類に300千円が必要である。その他、学会発表を行うための旅費として100千円を、実験補助のための人件費として150千円を外国語論文の校閲費や印刷費などに、200千円を試算している。
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Research Products
(8 results)
