2012 Fiscal Year Annual Research Report
ＲＳＥーＰＣＲと次世代シーケンサによるマイクロサテライトマーカーの簡便大量開発法
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24658138
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
白石 進 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (70226314)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | DNAマーカー / マイクロサテライト / ４塩基繰返し / 森林科学 / 育種学 / 分子生態学 |
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| Research Abstract |
近年，育種学，遺伝学および生態学の分野で広く用いられているDNAマーカーの中で，最も変異性（多様性）に富み，高い遺伝情報量を有するマイクロサテライト（以下，MS）マーカーの新規開発法を構築した。次世代シーケンサーの特性を活用することにより，従来法で膨大な作業と大きな経費を要していたMS領域のDNA断片のクローニングと塩基配列情報の取得を，簡便・安価に行うことが可能となった。その概要は次の通りである。
１．RSE-PCR（Restriction Site Extension PCR）法とアダプター付加法との比較検討：RSE-PCRによるMS領域のエンリッチメントについて検討を行い，4種類の制限酵素を用いた分析系を構築した。また，5制限酵素を用いたアダプター付加法による系を構築し，両者を比較した結果，RSE-PCR法は簡便性では若干優れていたが，再現性ではアダプター付加法の方が明らかに優れていたことから，アダプター付加法を採用した。
２. モデルDNAによるMSマーカー作出プロトコールの確立：DNA配列中に5種類の4塩基繰返し配列（(CAAA)n，(CATA) n，(GAAA)n，(GATA)n，(GACA)n）と2種類の2塩基繰返し配列（(CA)n，(GA)n）を組み込んだモデルDNAを作成し，アダプター付加法におけるエンリッチメント等のPCR条件を詳細に検討した。その結果，4塩基繰返しMSを選択的に増幅するPCR条件を確定した
３. スギおよびクロマツにおけるMSライブラリーの構築：上記方法を用いて，スギとクロマツにおいて4塩基繰返しMSライブラリーを作成した。
4．従来法と新規法の比較：新規法と従来法でのマーカー開発の効率等を評価するため，マツ属の2樹種において従来法による4塩基繰返しMSマーカーの開発を行った。従来法で開発されたマーカー数は，わずか12～13個であった。
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