ＴＡＬＥを利用した配列特異的な遺伝子発現抑制法及び欠失変異導入法の確立

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24658283
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (60560779)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / 植物 / TALEN

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、植物で効率よく働くTranscription activator-like nuclease (TALEN)の系を構築した。本研究の成果は以下の1～3の通りである。1. Arabidopsis thalianaのコドン頻度に最適化したTALE骨格を構築した。我々が構築した系は、「異なるエピトープタグの付加により各TALENの検出が容易」、「イントロンの挿入によるアグロバクテリウム内での異所発現の防止」、「ヘテロダイマー型のFokI-DNA切断ドメインの利用によるOff-target効果の低減」、「各Repeat variable di-residuesユニットへのサイレント変異導入により、連結後のTALEN全長のシークエンス解析が可能」などの特徴を持つ。2. 構築したTALENが植物細胞内で標的のDNA配列に結合するかどうかを確認するために、Nicotiana benthamianaを用いた一過的ルシフェラーゼアッセイ系を構築した。この系では、連結したTALEのDNA結合ドメインにAvrBs3遺伝子の転写活性化ドメインを付加したものを用いた。この系の構築により、植物を形質転換する前段階で、構築したTALENが核内で標的のDNA領域に結合するかどうかを判断することが可能となった。我々の構築したTALE系を転写活性化研究に用いることも可能となった。3. 構築したTALENの系を用いて、A. thalianaとN. benthamianaのゲノム編集を行った。N. benthamianaのTOM1/TOM3遺伝子、A. thalianaのMIRNA遺伝子座を標的に、欠失変異体の単離を試みた。PCRとシークエンス解析によって欠失変異の導入を確認したが、劣性ホモ植物の選抜までは完了しなかった。研究期間は終了したが、これらの変異体植物の解析を進めた後、成果を発表したいと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Roles and programming of Arabidopsis ARGONAUTE proteins during Turnip mosaic virus infection (2015)
  • Author(s): Garcia-Ruiz H., Carbonell A., Hoyer S. J., Fahlgren N., Gilbert K. B., Takeda A., Giampetruzzi A., Garcia-Ruiz M. T., McGinn M. G., Lowery N., Baladejo M. T. M. and Carrington J. C.
  • Journal Title: PLoS Pathogens Volume: 11 Pages: e1004755
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1004755
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Localization of tobacco germin-like protein 1 in leaf intercellular space (2014)
  • Author(s): Kishi-Kaboshi M., Muto H., Takeda A., Murata T., Hasebe M. and Watanabe Y.
  • Journal Title: Plant Physiology and Biochemistry Volume: 85 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.plaphy.2014.10.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Studies on molecular mechanisms of RNA silencing-mediated anti-virus defense in plants and RNA silencing suppression by plant viruses (2014)
  • Author(s): Takeda A.
  • Journal Title: Journal of General Plant Pathology Volume: 80 Pages: 527-528
  • DOI: 10.1007/s10327-014-0548-9
• [Journal Article] Recovery of dicer-like 1-late flowering phenotype by miR172 expressed by the non-canonical DCL4-dependent biogenesis pathway (2014)
  • Author(s): Tsuzuki M., Takeda A. and Watanabe Y.
  • Journal Title: RNA Volume: 20 Pages: 1320-1327
  • DOI: 10.1261/rna.044966.114
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] AGO1-ウイルス由来siRNAの標的遺伝子予測を目指して (2015)
  • Author(s): 唐戸俊介、白谷公孝、都筑正行、渡邊雄一郎、竹田篤史
  • Organizer: 第100回日本植物病理学会
  • Place of Presentation: 明治大学（東京都・千代田区）
  • Year and Date: 2015-03-29
• [Presentation] 植物microRNAの特異性に関する研究 (2014)
  • Author(s): 唐戸俊介、都筑正行、白谷公孝、渡邊雄一郎、竹田篤史
  • Organizer: 第78回日本植物学会
  • Place of Presentation: 明治大学（神奈川県・川崎市）
  • Year and Date: 2014-09-12 – 2014-09-14
• [Presentation] miR172強制発現によるシロイヌナズナDicer-like 1変異体の部分相補 (2014)
  • Author(s): 都筑正行、竹田篤史、渡邊雄一郎
  • Organizer: 第78回日本植物学会
  • Place of Presentation: 明治大学（神奈川県・川崎市）
  • Year and Date: 2014-09-12 – 2014-09-14