2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24659015
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
輿石 一郎 群馬大学, 保健学研究科, 教授 (20170235)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Proximity Ligation Assay / リアルタイムPCR / 脂質ラフト / 抗糖鎖自己抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Proximity Ligation Assay（PLA）法を用いたリアルタイムPCRによる定量分析法を糖鎖情報解析に応用するための開発研究を実施した。PLA法は、異なる2つのマーカーDNAが近接している場合にのみ検出することが可能な空間位置情報解析法である。応用展開として、①細胞膜における糖鎖クラスタリングの相対的評価、②糖鎖自己抗体の網羅的検出、を目標とした。最初に、細胞膜脂質ラフトの形成を数値化するため、脂質ラフトに集積することが知られているガングリオシドGM1に対し特異的親和性を有するコレラトキシンBサブユニットをプローブとした。ビオチン修飾したコレラトキシンBサブユニットを2郡に分け、各々に、アビジンを介してPLAプローブDNA(A)およびPLAプローブDNA(B)を結合させた。これら2種類のマーカーDNAで標識したコレラトキシンBサブユニットを用いることで、GM1のクラスタリングをリアルタイムPCRによるCt値として数値化することを可能とした。ついで、糖鎖還元末端にPLAプローブDNA(A)を結合させ、抗免疫グロブリン抗体にPLAプローブDNA(B)を結合させ、抗糖鎖自己抗体の検出法について検討した。糖鎖へDNAプローブを直接結合させることは、市販のPLAキットでは対応できないため、全てのPLA用試薬を独自に開発した。DNAプローブの5’末端または3’末端に活性型官能基を導入し、糖鎖還元末端へ直接DNAプローブを導入する手法を開発した。また、ビオチニル化した抗免疫グロブリン抗体に対しては、アビジンを介してPLAプローブDNAを結合させた。本手法により、抗糖鎖自己抗体に対して、分子数として定量下限60,000、検出下限6,000を達成することが可能となった。この手法を用いることで、糖鎖のみを替えることで抗糖鎖自己抗体の検出が可能となった。
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Research Products
(2 results)
