2012 Fiscal Year Annual Research Report
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24659044
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
横田 隆徳 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90231688)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | アンチセンス / 核酸医薬 / デリバリー / 後根神経節細胞 / ELISA / RT-PCR / PNA / ホスホロチオエート結合修飾 |
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| Research Abstract |
①３本鎖ASOの鎖長及び各種化学修飾の最適化
cRNAについては、両末端にPS及び2’-O-メチル修飾(2’-OMe)を加えているが、核内でRNaseHに認識され、切断されるために中央部のDNAと相補となる部分に化学修飾を加えていない。そのため標的細胞である肝細胞に辿りつくまでに分解されている危険性がある。cRNAの中央部についても各種化学修飾を試み、ホスホロチオエート結合修飾を行なっても有効性に問題ことが判明した。PNAについてはin vivoで解離しない適切な鎖長は9残基で、また、PNAとLNAの間の距離は0でも１残基でも問題ないことを見出した。
②中枢神経系へのデリバリーに際して有効な導入ペプチド配列の検討
神経系へのデリバリーする導入ペプチドとして、既報告の後根神経節細胞へのデリバリーペプチドを用いて、３本鎖ASOの主鎖の有効な後根神経節細胞へのデリバリーを以下の方法で確認した。さらに、後根神経節細胞での標的遺伝子の抑制が確認できた。
③dsASOの生体内分布の確認
３本鎖ASO 5'末端を 蛍光物質で、3'末端をクエンチャー物質で修飾してマウスに髄腔内投与し、共焦点顕微鏡で後根神経節細胞を観察した。その結果、３本鎖それぞれの後根神経節細胞へのデリバリーを確認した。更に、主鎖の分離は細胞質で行われ、核には主鎖のみが移行している知見を得た。マウスへの静脈投与でも、主鎖のシグナルを弱いながらも観察できた。主鎖核酸の定量方法としてELISAの感度は不十分であったが、定量的RT-PCR方法を開発して、３本鎖ASOの主鎖の有効な後根神経節細胞へのデリバリーを定量的RT-PCRによって確認した。
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