2012 Fiscal Year Research-status Report
未知なる細胞容積感受性アニオンチャネルの分子構造基盤の解明
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24659095
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
酒井 秀紀 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 教授 (60242509)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 貴浩 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (40353437)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 生理学 / 細胞・組織 / 蛋白質 / イオンチャネル / 細胞容積 / 浸透圧 / アポトーシス |
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| Research Abstract |
細胞容積の制御に寄与する容積感受性アニオンチャネル（VSOR）は、「細胞の生死を制御するイオンチャネル」として注目されているが、その分子実体は世界中の研究者の多大なる尽力にもかかわらず、明らかとなっていない。本研究では、VSORの特異的阻害薬を基盤とした光アフィニティーラベル体を作製し、独創的な蛋白質単離法により、VSORの分子実体を世界に先駆けて明らかにすることを目指す。本年度は、以下のような興味深い成果を得た。
１．VSOR特異的阻害薬のDCPIBの構造を基盤として合成した光アフィニティープローブを、VSORを機能的に発現しているヒト口腔類表皮癌KB細胞に作用させ（UV照射）、膜フラクションを調製後、ラべリング蛋白質をアビジンカラムにより単離し、LC/MS/MSによるショットガン解析を行った。その結果、VSOR候補としての可能性を有する約10種の膜貫通蛋白質がリストアップできた。
２．KB細胞およびKB細胞由来でVSORの機能的発現が顕著に減少しているシスプラチン耐性株（KCP-4細胞）から膜フラクションを調製し、二次元電気泳動を行い、KB細胞とKCP-4細胞との間で発現量が異なる蛋白質を調べた。KCP-4細胞よりもKB細胞での発現量が多いメインスポットを5種採取し、MALDI-TOFMSにより蛋白質の同定を行ったところ、このうちの1種（仮称：VC-1）が前述のショットガン解析で得られた蛋白質と一致していた。これまでにVC-1がVSORであるという報告はない。
３．KB細胞において、VC-1をsiRNAによりノックダウンし、低張負荷時に賦活化するVSOR電流に対する効果をホールセルパッチクランプ法により検討した。その結果、MP-1のノックダウンに伴い、VSOR電流が有意に減少することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、極めて重要な生理機能を有するにもかかわらず、その分子実体が未解明の容積感受性アニオンチャネル（VSOR）に着目した。これまでVSORの候補として様々な分子が提唱され、いずれもトップジャーナルに掲載されてきているが、後のノックアウトマウスでの実験によりそのすべてがVSORの分子実体ではないと否定されている。我々は、VSOR特異的阻害薬（DCPIB）の光アフィニティーラベル体を作製し、新規アプローチによりVSORの分子実体解明を目指している。本年度は、1) ラベリング蛋白質のLC/MS/MSによるショットガン解析、2) VSOR活性の異なる細胞株における各種蛋白質の発現量比較に基づく解析を行い、VC-1（仮称）を候補蛋白質の一つとしてピックアップした。興味深いことに、KB細胞におけるVC-1のノックダウンにより、VSOR電流が顕著に抑制されたことから、VC-1がVSORの分子実体またはVSOR活性の調節因子として機能している可能性が高い。以上のことから、本研究は、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、以下のように研究を推進し、VSORの分子実体解明を目指す。
１．VC-1をKCP-4細胞に過剰発現させ、VSOR電流が増大するかどうかをパッチクランプ法により検討する。また、VC-1の膜トポロジーを推定し、チャネルポアとなる可能性のある領域において様々な変異体を作成し、KCP-4細胞に過剰発現させる。そしてチャネルのイオン選択性が変化する領域を明らかにする。
２．VC-1をノックダウンしたKB細胞において、低浸透圧刺激後の細胞容積変化がどのような影響を受けるのかを検討する。またこの細胞において、シスプラチンがアポトーシスを誘導することができるのかについても検討する。
３．VC-1ノックアウトマウス由来の細胞株を用いて、VSOR活性の検討ならび上記２の検討を行う。
上記１～３の実験により、VC-1がVSORの分子実体であるのか、あるいはVSORの機能調節蛋白質であるのかを確定する。分子実体でなかった場合は、膜蛋白質精製法のさらなる改善や光反応基の異なるプローブの作製等を行い、ショットガン解析による候補蛋白質の再探索を行う。また、VC-1がVSOR調節因子であれば、VC-1とVSORが会合している可能性が高いので、VC-1に結合する蛋白質の探索・同定を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24年度は、557円の残額が生じたが、これは研究計画の変更や進行状況の変化等によるものではなく、557円以下の物品の購入を希望しなかったためである。当該助成金は平成25年度の助成金と共に消耗品の購入に充てる。
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[Journal Article]2012
Author(s)
Nishi M, Aoyama F, Kisa F, Zhu H, Sun M, Lin P, Ohta H, Van B, Yamamoto S, Kakizawa S, Sakai H, Ma J, Sawaguchi A, Takeshima H
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 287
Pages: 33523-33532
DOI
Peer Reviewed
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