2012 Fiscal Year Research-status Report

記憶Ｂ細胞の可視化による記憶免疫応答ダイナミクスの解析

Research Project

Project/Area Number	24659222
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	伊勢渉大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任准教授 (70323483)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2014-03-31
Keywords	記憶免疫 / B細胞 / 蛍光ラベル
Research Abstract	1）本年度は記憶IgM B細胞を特異的に蛍光ラベルでき、かつ誘導的に除去できるマウス（記憶IgM B-Venus-DTRマウス）を作製することができた。まず抗体重鎖定常領域のCmu遺伝子の下流にflox-STOP-IRES-Venus-DTRカセットをノックインしたコンストラクトを作製し、ES細胞のターゲティングを行った。このES細胞からキメラマウスが順調に誕生し、そしてジャームライントランスミッションが確認された。現在このマウスをAIDプロモーターの制御下でCre-recombinaseが発現するAID-Cre Tgマウスと交配を行なっているところである。 2）上述のマウスと同様に、記憶IgG B細胞を蛍光ラベルできるマウスを交配により樹立した。IgG1の定常部遺伝子Cg1が転写されるとCre-recombinaseを発現するIgG1-Creマウスと、ROSA26遺伝子座にflox-STOP-RFPがノックインされたROSA-RFPマウスを交配することにより目的のマウスを得た。このマウスに抗原を投与すると、活性化によりIgMからIgG1にクラススイッチしたB細胞がRFPを発現する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 交付申請段階では1）記憶IgM B-Venus-DTRマウスの作製、2）記憶IgG B-RFPマウスの作製を計画し、申請書にその計画を記載した。まず1)のIgM B Venus-DTRマウスについては、マウスそのものを樹立することができた。当初の計画ではAID-Cre-Tgとの交配も終了しているところであるが、進捗に若干の遅れがあり、現在交配中である。しかし今年度の早い時期に目的のマウスを得て、解析を開始できる予定である。また2）の記憶IgG B-RFPマウスについては、予定通り目的のマウスを樹立した。以上よりここまでの達成度は「おおむね順調に進んでいる」と考えている。数年前に記憶IgM細胞の存在と記憶IgG細胞との機能的な違いが報告され、記憶B細胞の多様性が注目されている。しかし記憶IgM細胞を特異的にラベルする方法が確立されておらず、抗原未感作なナイーブIgM細胞との厳密な識別方法は存在しない。その点本研究で樹立した記憶IgM B-Venus-DTRマウスを用いることでナイーブIgM細胞と記憶IgM B細胞の識別が可能であり、かつ記憶IgM B細胞の除去が可能となる。したがって記憶IgM B-Venus-DTRマウスを樹立できたことにより、この分野の進歩に大いに貢献できる可能性がある。
Strategy for Future Research Activity	次年度は樹立した記憶IgM B-Venus-DTRマウスおよび記憶IgG B-RFPマウスを利用して以下の研究を行う予定である。 1）樹立したマウスモデルの有効性：樹立したマウスを抗原で免疫し、誘導される記憶B細胞が予測通りVenusあるいはRFPでラベルされるかどうかを検証する。VenusあるいはRFP陽性細胞を様々な記憶B細胞マーカーで染色すると同時に、その記憶B細胞としての機能を移入実験を用いて評価する。 2）記憶B細胞の生成のkinetics、局在、および機能の解析：記憶IgM B-Venus-DTRあるいは記憶IgG B-RFPマウスを抗原で免疫し、経時的に記憶B細胞の頻度・数をFACSを用いて解析する。さらに免疫組織染色を用いてリンパ組織内での局在を観察する。さらにVenusあるいはRFP陽性細胞を分離し、これをマウスに移植後、抗原で免疫し、記憶免疫応答における機能の違い（抗体産生細胞や胚中心細胞への分化能の違いなど）を解析する。 3）記憶IgM細胞の特異的除去が記憶免疫応答に与える影響：これまで記憶IgM B細胞と記憶IgG B細胞の機能的な違いは示唆されているものの、遺伝子工学的手法での検討は一切なされていない。樹立した記憶IgM B-Venus-DTRマウスに抗原を投与し、記憶B細胞を誘導した後に、DT（ジフテリア毒素）を投与し、DTRを発現する記憶IgM B細胞を除去する。その後追加免疫を行い、二次免疫で誘導される抗体産生応答における記憶IgM B細胞の機能を明確に示す。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	次年度は国内旅費（学会での研究成果発表）として5万円程度を使用する。残りの研究費は全て物品費にあてる予定である。物品費としては、抗体、実験動物（マウス）、細胞培養器具（プレート、シャーレ、ピペット等）、培地、酵素等の購入を計画している。一品が50万円を超える物品の購入は計画していない。