2012 Fiscal Year Research-status Report
小分子応答性人工受容体による増殖因子シグナル伝達制御を用いた心筋再生療法の確立
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24659388
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
川村 晃久 京都大学, 生命科学系キャリアパス形成ユニット, 助教 (90393199)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 再生医学 / 幹細胞生物学 / 人工受容体 |
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| Research Abstract |
重症心不全に対する、人工多能性幹(iPS)細胞を用いた再生療法が期待されている。Wnt分子や顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)などの増殖因子は心筋細胞分化促進効果や心筋保護作用などを有しており、これらの因子によるシグナル伝達を制御することは、iPS細胞からの効率的な心筋細胞誘導だけでなく、移植後の生着効率の改善にも繋がると考えられる。しかし、増殖因子の生体投与は移植細胞以外にも作用するため、その副作用が懸念される。また、Wnt分子は、生体で安定して作用する組換え蛋白質が精製困難な状況である。そこで、本研究では、生体において安定でかつ毒性のない小分子リガンドに応答する人工受容体を用いて増殖因子のシグナル伝達を制御する方法を開発し、これを細胞治療へ応用した次世代心筋再生療法の基盤を構築する。
はじめに、G-CSF結合領域あるいは細胞外ドメインすべてを、抗フルオレセイン（FL）抗体のsingle chain Fv (ScFv)に置換したキメラG-CSF受容体を作製した。この受容体は、BSAに複数のFL分子を修飾したBSA-FLがリガンドとして結合すると、ホモ二量体を形成しシグナル経路を活性化すると考えられる。そこで、キメラG-CSF受容体を安定発現するマウスES細胞株を樹立し、分化培養過程で、代替リガンドであるBSA-FLにより刺激し、それぞれのシグナル経路の活性化を検証したところ、G-CSF受容体経路の下流の転写因子STAT3においてリン酸化が誘導されることを確認した。今後、iPS細胞株においても、同様に安定発現株を作成し、分化誘導後、代替リガンド刺激において心筋細胞分化効率、細胞死抑制効果などを確認する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
キメラ受容体からのシグナル伝達は、細胞外ドメインの構造の違いによって影響を受けることが予想される。そこで、本年度は、細胞外ドメインの異なる数種類のキメラ受容体を構築した。次に、本来の受容体が持つシグナル伝達能力を有していることを検証するために、STAT3のリン酸化をウェスタンブロットにより確認した。最も効率良くシグナル伝達できるキメラ受容体を、CAGプロモーターを組み込んだレンチウイルスベクターにより遺伝子導入したES細胞株を樹立することに成功した。次年度は、このキメラ受容体をiPS細胞に安定発現させ、代替リガンド刺激後の心筋細胞分化や抗アポトーシス効果を検証する予定である。上記ように、本研究では、予定通り実験計画が進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、このキメラ受容体を、安定発現するiPS細胞株を樹立することにより、心代替リガンド刺激後の心筋細胞分化効率や抗アポトーシス効果を検証する予定である。
さらに、分化誘導した心筋細胞を、心筋梗塞モデルのマウス心へ移植する。さらに、生体へリガンドを投与し、移植細胞でのみシグナルを一過性に活性化させることで、アポトーシス抑制による生着効率の改善を試みる。光イメージングでは、ルシフェラーゼ発光や赤色蛍光を同一個体で経時的に追跡可能であり、移植した細胞のリガンド応答性や心筋細胞としての生着率を生体で解析する。最終的には、移植片が心筋細胞として組織へどのように生着しているか、多種の細胞や奇形腫として生着していないことを確認する目的で、組織学的評価を行う。さらに、心エコーや心カテーテル法などの生理学的方法により心機能改善効果の検証も行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
iPS細胞の培養、遺伝子導入、心筋細胞分化にかかわる細胞培養実験の試薬などに関する消耗品購入に使用する。さらに、マウスを用いた心筋梗塞モデル作成のための、マウス飼育費、マウス手術にかかる麻酔薬の購入、手術道具などの購入に使用する。最後に、細胞移植後の、光イメージング施行に関わる費用、心機能評価として生理学的検査、組織学的実験、遺伝子発現などの分子生物学的実験にかかる消耗品費に使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
