2014 Fiscal Year Annual Research Report
肺血管異常におけるＴＧＦーβ関連遺伝子変化の包括的検索とその役割の検討
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24659408
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
萩原 弘一 埼玉医科大学, 医学部, 客員教授 (00240705)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | TGF-β / エクソーム / 血管異常 / 形態形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，肺動脈の形態異常を有する患者の全エクソンシークエンスを行い，TGF-β familyタンパク，およびそのシグナル伝達に関わる遺伝子に注目して，機能に変化を来すと考えられるバリアントを同定し，血管形成に与える影響を検討するものである．倫理委員会で承認された文書を用い，胸部CTにより，明確な肺血管走行異常を有する患者より文書同意を取得した．患者の末梢血をEpstein-Barrウイルスで不死化し，B細胞を株価して保存した．同時に末梢血白血球よりDNAを抽出し，SureSelect All Exon 50 Mb Kitによりexon 部分を抽出．Pair-end DNA Sample Prep Kit（Illumina）にてゲノムライブラリーを作成した．ゲノムDNAは，Covaris Sアコースティックソルビライザーを用いて断片化した．末端に3'-dA突出末端を付加し，アダプターを連結．PCRにより4サイクルの増幅を行った．作成したライブラリーをビオチン化RNAプローブとハイブリダイゼーションさせ，ストレプトアビジン磁気ビーズにより回収した．回収したゲノムライブラリーをPCRで増幅し，シークエンス解析に用いた．シークエンスは，Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて行った．収集したシークエンスをヒトゲノム参照配列にマッピング，バリアントを抽出した．抽出したバリアントのうち，TGF-β familyタンパク，およびそのシグナル伝達に関わる遺伝子のものを選択，さらに同定したバリアントのうち，Genbankデータベースで観察される頻度の低いバリアントを抽出した．それらのバリアントのうち，アミノ酸の変化の大きいものをさらに抽出．機能検討対象とした．現在，それらのバリアントの解析を行っている．
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