2012 Fiscal Year Research-status Report
ＦＸＹＤ５の甲状腺癌細胞接着への関与とプロテオーム解析による関連蛋白質の検討
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24659455
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
佐藤 温洋 東海大学, 医学部, 准教授 (70317808)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 5XDYD / Eカドヘリン |
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| Research Abstract |
(1) 甲状腺癌細胞培養：甲状腺未分化癌由来培養細胞を培養し対象とする。(2)5XDYD5・Eカドヘリンの発現量の定量と細胞内局在の観察A. 蛋白質の発現量：上記細胞をtrypsin-EDTAにて浮遊させ、抗FXYD5・マウス・モノクローナル抗体 (Clone 3G-10、廣橋説雄博士より分与)および抗Eカドヘリン・マウス・モノクロナール抗体を用いてウェスタンブロットおよび蛍光色素ラベル-抗マウス抗体にて染色後FACS Aria Cell Sorter(BECKTON DICKINSON)にて解析しFXYD5シグナルとEカドヘリンシグナルの強度を測定する。B. mRNAの発現量：9種からTRIZOL (Invitorgen)によりRNAを抽出する。cDNAを合成し、SYGR存在下に定量的PCR (Applied Biosystem社Model7300)を行ない、FXYD5mRNAの定量をする。C. 培養細胞各株をchamber slideに培養し抗FXYD5・マウス・モノクローナル抗体および抗Eカドヘリン・マウス・モノクロナール抗体にて免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で細胞内の局在を観察する。(3)各細胞株の凝集能の測定。各培養細胞を0.01%trypsin、5mMCaCl2添加HCMFにて単離・浮遊させる。10mM Hepes(pH 7.4)、150mM NaCl、1%BSA、5mM Ca2+中にて80rpm、30分間攪拌後、細胞凝集塊をカウントする事により細胞凝集能を評価し、FXYD5とEカドヘリン発現による細胞凝集能の差異を検討するともに、以下の強制発現とノックダウンのコントロールとする。(4)FXYD5低発現細胞株に対するFXYD5強制発現の影響
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の仮説が確実であり、初年度の研究計画に無理が無く、研究時間の確保が充分に行われているとともに、研究結果の解析と次の研究計画への連続性に優れていたとともに連携研究者との協力が密接かつ上手くいったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
FXYD5強制発現細胞とRNAiによるFXYD5ノックダウン細胞の特性解析。
方法(4)および(5)で得られた細胞の特性解析を下記の方法にて行う。
細胞形態の確認。FXYD5強制発現細胞は、上皮様形態を消失し紡錘形、多形性の強い肉腫細胞に類似した形態に変化し、またFXYD5・ノックダウン細胞は多形性の強い細胞から上皮様形態に変化すると予測している。
細胞遊走能の解析、細胞の移動軌跡を可視化し、細胞遊走能を測定する。またboyden chamber法も用いて細胞遊走能を評価する。FXYD5強制発現細胞は遊走能が亢進し、FXYD5・ノックダウン細胞は遊走能が低下することを推測している。
肝転移能アッセイ。生後6週SCIDマウスにFXYD5強制発現細胞およびFXYD5・ノックダウン細胞を各々、脾臓内に注入し2週間後、脾臓内転移および肝転移の有無を評価する。FXYD5強制発現細胞は脾臓内転移および肝転移いずれも著明に認め、FXYD5・ノックダウン細胞は転移能が低下することを予測している。
プロテオミクス解析を用いたFXYD5強制発現およびノックダウン細胞における蛋白質発現変化の観察によるFXYD5関連蛋白質の同定。FXYD5強制発現およびノックダウン細胞から蛋白質を抽出、2次元電気泳動を行い、Coomassie blue染色で分離した蛋白質をspotとして表出させる。ディスアドヘリンを強制発現させる前の細胞をコントロールとして、そのspotを比較し、FXYD5強制発現もしくはノックダウンにより発現が誘導された、あるいは減弱したspotを同定する。Spotから蛋白質を抽出し濃縮した後に解析し現変化のある既知および未知の蛋白質の同定を行う。これにより全く不明だったディスアドヘリンの下流で機能する蛋白質の同定が期待される。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
繰り越した約50万円については試薬などの消耗品の購入にあてるとともに、英文校正料として使用する予定である。
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