2012 Fiscal Year Research-status Report
ＰＷＳにおける食欲亢進および性格異常の原因分子機構の解明
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24659505
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
弟子丸 正伸 福岡大学, 理学部, 准教授 (70309889)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | snoRNA / mRNA 2'-O-メチル化 / プラダー・ウィリ症候群 / RNA編集 / 変異ノックインマウス |
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| Research Abstract |
以前に構築したMBII-52 snoRNA部位ターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、標的相同組換えによる変異受容細胞（アクセプター細胞）の取得を目指した。5回の試行にも関わらず、標的とするMBII-52遺伝子部位に適切な組換えが起きた細胞クローンは得られなかった。これは、標的とするゲノムDNA領域が約100kbと長大であるため、単一のターゲティングベクターを用いた一般的な手法では組換えが困難であることを反映していると考えられた。そこで、標的部位上流側と下流側に個別の標的組換えを施すため、ネオマイシン耐性遺伝子をもつ上流側用ターゲティングベクターおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む下流側用ターゲティングベクターを作製し、順次組換えることによりアクセプター細胞を得る方針に変更した。現在、これらの新たなターゲティングベクターの構築を進めている。
一方、アクセプター細胞のMBII-52遺伝子に変異導入するための変異カセットの構築のため、マウスゲノムライブラリーよりMBII-52遺伝子断片のクローニングを検索した。その結果、47個のMBII-52遺伝子のクラスターから成る約100kbのDNA断片を含むBACクローンを取得した。このMBII-52遺伝子クラスターのうち15および30個の遺伝子を欠失した変異遺伝子の作製をPCRにより試みたが、目的とするDNA断片の増幅は困難であった。これは類似の塩基配列が高度に反復されているためと考えられ、現在PCRの条件を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
次の2点が計画より大幅に遅れている。
（１）マウスES細胞を用いたMBII-52遺伝子変異アクセプター細胞の構築が、初年度に達成できなかった。これは、標的とするゲノムDNA領域が約100kbと長大であるため、単一のターゲティングベクターを用いた一般的な手法では組換えが困難であることを反映していると考えられた。標的部位の上下流2か所をそれぞれ標的とした2つのターゲティングベクターを用いて順次相同組換えを行う必要があると考えられる。
（２）変異導入に用いるMBII-52遺伝子クラスターの欠失変異体の構築が、予想に反して難航している。これは、遺伝子クラスター断片が高度な反復配列で構成されているため、一般的なPCRによる部分断片の構築が困難であるためと考えられる。PCRの条件検討により克服可能と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）MBII-52遺伝子への容易な変異導入を可能にするための変異アクセプター細胞の早期樹立を目指す。このため、マウスES細胞の相同組換え操作の際に、2種のターゲティングベクターの順次導入による方法とともに、一括導入による効率的な相同組換えを目指す。
（２）MBII-52遺伝子クラスター断片への変異（欠失）導入のため、PCRの酵素・反応条件などの変更を試みる。それでも困難な場合には、エクソヌクレアーゼを用いた欠失導入法を試みる計画である。
上記の遂行により、次段階の変異マウス作製への早期着手を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
変異マウス作製までの工程が遅れているため、次年度はマウス飼育および動物実験委託のための人件費は不要と考えられる。一方、遺伝子工学的手法を用いた多くの実験を継続するため、その試薬・器具購入のため、より多くの物品費が必要である。よって、交付予定額の多くの割合を物品費として支出する計画である。
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