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2013 Fiscal Year Research-status Report

PWSにおける食欲亢進および性格異常の原因分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number 24659505
Research InstitutionFukuoka University

Principal Investigator

弟子丸 正伸  福岡大学, 理学部, 准教授 (70309889)

Keywords転写後修飾 / snoRNA / 2'-O-メチル化 / プラダー・ウィリ症候群 / 疾患モデル動物
Research Abstract

昨年度に引き続き、MBII-52 snoRNA部位ターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、標的相同組換えによる変異受容細胞(アクセプター細胞)の取得を目指した。標的とするゲノムDNA領域が約100kbと長大であり、単一のターゲティングベクターを用いた一般的な手法では組換えが困難であったため、ターゲティングベクターの設計を変更した。標的部位の上流側および下流側で個別に標的組換えを施すため、ネオマイシン耐性遺伝子をもつ上流側用ターゲティングベクターおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む下流側用ターゲティングベクターを構築した。標的組換えの工程では、マウスES細胞に上記2種のベクターを共導入し,2種の抗生物質に耐性をもつ細胞クローンを複数単離した。得られたクローンについて、PCRおよびサザンブロット解析により選別を行ったが、期待される組換えをもつクローンは得られなかった。現在、2種のベクターを順次導入する方法を試みている。一方、アクセプター細胞が得られた後にMBII-52遺伝子に変異導入するための変異カセットの構築のため、MBII-52遺伝子クラスターを含むBACクローンから15および30個の遺伝子を欠失した変異遺伝子の作製をPCRにより試みた。しかし、目的とするDNA断片の増幅が難航している。これは類似の塩基配列が高度に反復されているためと考えられ、現在PCRの条件を検討中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

(1) 標的組換えの対象と想定しているゲノム領域が約100 kbと非常に長大であり、従来の標的組換え手法が適用できないことが明らかとなった。
(2) 変異導入に用いるベクターの構築ではsnoRNA遺伝子クラスターをクローニングしその部分断片を得る必要があるが、高度な反復配列を含むため、標的とする配列領域をPCRにより正確に増幅することが困難であった。

Strategy for Future Research Activity

(1) 計画していた技術では、100 kb程度のゲノム領域を一括して標的組換えすることは困難と思われた。そのため、ターゲティングベクターを標的領域の上流側用および下流側用の2つに分割し、それらを順次ES細胞へ導入することにより標的組換え細胞を確実に得ることを目指した実験を実施している。
(2) 変異導入に用いるためにsnoRNA遺伝子クラスターの部分断片を得る必要があるが、PCRでは期待された断片を増幅することが不可能であった。そこで、超音波やエンドヌクレアーゼを用いたランダムな切断により種々の部分断片を作成し、それらの中から目的に適した断片を選別する実験を計画中である。

  • Research Products

    (16 results)

All 2014 2013

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (14 results)

  • [Journal Article] The kick-in system: a novel rapid knock-in strategy.2014

    • Author(s)
      Tomonoh Y, Deshimaru M, Araki K, Miyazaki Y, Arasaki T, Tanaka Y, Kitamura H, Mori F, Wakabayashi K, Yamashita S, Saito R, Itoh M, Uchida T, Yamada J, Migita K, Ueno S, Kitaura H, Kakita A, Lossin C, Takano Y, Hirose S.
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 9 Pages: e88549

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0088549

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Improved design of hammerhead ribozyme for selective digestion of target RNA through recognition of site-specific adenosine-to-inosine RNA editing.2014

    • Author(s)
      Fukuda M, Kurihara K, Yamaguchi S, Oyama Y, Deshimaru M.
    • Journal Title

      RNA

      Volume: 20 Pages: 392-405

    • DOI

      doi: 10.1261/rna.041202.113

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Alu配列のA-to-I RNA編集におけるADARアイソフォームの異なる作用2013

    • Author(s)
      田中泰圭, 川副美鈴, 渋谷圭介, 加藤卓, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] マウス脳HTR2C mRNA における2’-O- メチル化がA-to-I 編集に及ぼす影響2013

    • Author(s)
      大蔵一聡, 山口彰太, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] A-to-I RNA編集パターンを制御するHTR2C RNAの構造的要因の解明2013

    • Author(s)
      小山唯, 加藤卓, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] 細胞を基盤としたRNA編集阻害剤のスクリーニング方法の開発2013

    • Author(s)
      尾村美樹, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] 標的遺伝子発現を制御するbox C/D型snoRNAの構築2013

    • Author(s)
      川本崇仁, 小山唯, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] 細胞を基盤としたRNA編集阻害剤スクリーニング方法の開発2013

    • Author(s)
      尾村美樹, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] RNA編集が引き起こすHTR2C mRNAの構造変化と編集パターンの関係2013

    • Author(s)
      小山唯, 加藤卓, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130911-20130913
  • [Presentation] 標的遺伝子発現を抑制するbox C/D型 snoRNAの構築2013

    • Author(s)
      川本崇仁, 小山唯, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第15回日本RNA学会年会
    • Place of Presentation
      愛媛県民文化会館・ひめぎんホール
    • Year and Date
      20130724-20130726
  • [Presentation] HTR2C pre-mRNAの構造とA-to-I RNA編集の関係2013

    • Author(s)
      小山唯, 加藤卓, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第15回日本RNA学会年会
    • Place of Presentation
      愛媛県民文化会館・ひめぎんホール
    • Year and Date
      20130724-20130726
  • [Presentation] 細胞を基盤としたRNA編集阻害剤スクリーニング方法の開発2013

    • Author(s)
      尾村美樹, 弟子丸正伸, 福田将虎
    • Organizer
      第15回日本RNA学会年会
    • Place of Presentation
      愛媛県民文化会館・ひめぎんホール
    • Year and Date
      20130724-20130726
  • [Presentation] Alu配列の A-to-I RNA編集におけるADARアイソフォームの異なる作用2013

    • Author(s)
      田中泰圭, 川副美鈴, 渋谷圭介, 加藤卓, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      第15回日本RNA学会年会
    • Place of Presentation
      愛媛県民文化会館・ひめぎんホール
    • Year and Date
      20130724-20130726
  • [Presentation] セロトニン2C型受容体mRNAの編集にsnoRNA MBII-52が及ぼす影響2013

    • Author(s)
      山口彰太, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      平成25年度 日本生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      佐賀大学
    • Year and Date
      20130518-20130519
  • [Presentation] RNA編集が誘起するHTR2C mRNAの構造変化と編集パターンの関係2013

    • Author(s)
      小山唯, 加藤卓, 福田将虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      平成25年度 日本生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      佐賀大学
    • Year and Date
      20130518-20130519
  • [Presentation] Alu配列のA-to-I RNA編集におけるADARアイソフォームの異なる作用2013

    • Author(s)
      田中泰圭, 川副美鈴, 渋谷圭介, 加藤卓, 福田将 虎, 弟子丸正伸
    • Organizer
      平成25年度 日本生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      佐賀大学
    • Year and Date
      20130518-20130519

URL: 

Published: 2015-05-28  

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