脊椎動物に普遍的な骨石灰化制御機構の解明

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24659685
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 松尾 光一 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40229422)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 遺伝子 / 細胞・組織 / 発現制御 / メダカ / 骨芽細胞

Research Abstract

メダカの骨芽細胞特異的Osterixプロモータの下流にマウスFra1-T2A-EGFPをつないだトランスジーンを作製し、マイクロインジェクションによりFra-1 メダカ (初代F0)を得た。その中からトランスジーンが生殖系列に移行する（第一世代　F1）メダカを得た。この中でEGFP の蛍光強度が比較的強いもの（つまりFra1の発現が高いもの）を選択し、野生型メダカと交配させF2を得た。同じ受精日および同じ孵化日のメダカを、対照群とFra-1 メダカで経時的に比較した。
【Fra-1 メダカの発現確認】Fra-1 メダカは、孵化し泳ぎだす前の受精卵の段階でGFP 陽性となった。すなわち、受精後3-4 日でEGFP 陽性卵が観察でき、受精後およそ8日後に孵化した。そこで、この孵化直後の対照メダカおよびFra-1 メダカを回収し、定量RT-PCR および、ウエスタンブロット法にてマウスFra-1 の発現を確認した。
【Fra-1 のメダカ骨格形態への影響の解析】全身性にFra-1 を発現するFra-1 マウスは、成長過程で進行性の骨形態異常を示す。そこで、メダカの骨をAlizarin complexoneを用いて生体染色し、メダカ骨格の形態学的異常の有無を探索したところ、形態異常は認められず、石灰化の低下が観察された。そこで小動物用マイクロCT 装置を用いて、メダカの全身の骨格を撮像したところ、形態学的異常がないこと、石灰化が低下していることが確認された。
以上のデータから、メダカにおいて骨芽細胞特異的にFra-1を強制発現すると骨の石灰化が低下することが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Fra-1トランスジェニックメダカの作出ができたことで、順調に進展していると言える。また、低石灰化という表現形質も、さらに解析する余地があるものの、alizarin染色とマイクロCTの両方で確認されたことから、研究を先に進める基盤ができたと考える。

Strategy for Future Research Activity

まず、石灰化の低下という表現形質を、発生段階において、von Kossa 法でカルシウムを染色するなどして、組織学的にも証明する。また、電子顕微鏡を用いて、石灰化の過程を解像度を上げて解析するなどして、現象論として精度の高い記述ができるようにする。　その上で、遺伝子発現の解析を行い、石灰化低下のメカニズムを明らかにする。matrix Gla protein（MGP)は、石灰化の阻害因子であり、この発現が上昇している可能性がある（Eferl et al, 2008, EMBO J)。この既存の考え方を超えられるかどうか検討する。
骨芽細胞特異的Fra-1の強制発現を、メダカに加えてマウスで行い、骨の表現形質を比較解析できないかどうかを検討したい。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の組織学的解析における特殊染色（von Kossa染色など）や電子顕微鏡による解析を行うために経費を使用する。
さらに遺伝子発現の解析を定量RT-PCRによって行う。メダカのマイクロアレイ（4x44K, Agilent）がカスタムアレイとして導入し、網羅的解析を行いたい。

Research Products

• [Presentation] Transgenic expression of mouse Fra-1 in osteoblasts reduces bone mineralization in medaka fish. (2012)
  • Author(s): Matsumoto, T., Takada, Y., Nakamura, T., Suematsu, M., Inohaya, K., Kudo, A., Shimizu, A., and Matsuo, K.
  • Organizer: 第18回 小型魚類研究会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 20120922-20120923