Ａｔｙｐｉｃａｌ ＰＫＣ経路を標的とした腎細胞癌に対する新規抗癌活性化合物の同定

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24659712
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中村 英二郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90293878)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: Renal Cell Carcinoma / VHL

Research Abstract

腎細胞癌（RCC）は全腎悪性腫瘍の約85％を占め、経年的に増加傾向を示している。初診時に約25％の症例が遠隔転移を有し、また、根治的腎摘除術を施行し得た場合でも約20％の症例で再発を認める。遠隔転移を有する症例では抗VEGF療法を中心とした治療が行われるがCRが得られる事は稀である。また、PRが得られた症例の殆が同療法に対する治療抵抗性を獲得するため、罹患例の約1/3が死亡に至る予後不良な疾患である。
本邦の2005年データーでは年間新規患者数が1.8万人、6132人が癌死している。また、全世界では2006年に209,000人が罹患し102,000人が癌死したと報告（Rini et al. Lancet 2009）されており新規治療薬の開発が急務である。従って、 本研究において発癌機構に基づいた新規治療標的の同定を行う。RCCは、その70-80%の症例でVHL遺伝子変異を認めることが知られている。我々は、RCC細胞株のプロテオーム解析によりpVHLで制御される新規分子としてclusterinを同定した。同分子はVHL遺伝子欠失に伴い発現が現弱する分子の一つとして、我々が報告を行ったが、実際のヒトRCC組織においてもが確認されていることより、腫瘍抑制機能を有していることが想定されている。上記の背景に基づいて、本年度は実験で使用する新規細胞株の樹立、及び、plasmidの構築を中心に行ってきた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これらの実験結果からVHL遺伝子欠失細胞においてclusterin発現を増強させる分子が治療標的分子、及び、VHL欠失にantagonizeする表現系（Revertant）をもたらす分子になり得ると想定される。上記の分子の探索を目的にclusterinのPromoter 領域のクローニングを行い、同分子の発現亢進に伴い786-O （VHL-/-） 細胞が薬剤耐性を獲得するスクリーニング系を樹立することに成功した。

Strategy for Future Research Activity

786-O （VHL-/-） 細胞より樹立されたCCL14細胞は、clusterinの発現亢進に伴い薬剤耐性を獲得する。同細胞にLenti-viral shRNA library をInfectionしBlastcidineにてPositive selectionを行ったところ、約８０クローンをpick upすることに成功した。今後は各クローンよりgenomic DNAを抽出しPCR法にてgenomeにIntegrateされたshRNA fragmentを回収しBlast Searchにより候補遺伝子を特定する。Off target効果を否定するために同定された分子に対する別のshRNAを作成し、clusterinの発現を亢進させる効果の確認、及び、786-O細胞に対する増殖抑制能を示すかどうか、併せて検討を行う。また、同様の傾向がA498（VHL-/-）細胞においても認められるか検討を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度は上記の実験を行うが、この場合、ミニプレップ、PCR、シークエンス、shRNA plasmid作成などのDNA関連実験試薬の購入、及び、外注に約５０万円、Western Blotや組織免疫染色など蛋白関連に約３０万円、マウスを用いたxenograft modelの作成などin vivo関連に４０万円、それぞれ使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Downregulation of Ral GTPase-activating protein promotes tumor invasion and metastasis of bladder cancer. (2013)
  • Author(s): Saito R, Shirakawa R, Nishiyama H, Kobayashi T, Kawato M, Kanno T, Nishizawa K, Matsui Y, Ohbayashi T, Horiguchi M, Nakamura T, Ikeda T, Yamane K, Nakayama E, Nakamura E, Toda Y, Kimura T, Kita T, Ogawa O, Horiuchi H.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 32 Pages: 894-902
  • DOI: 10.1038/onc.2012.101.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumor microvasculature with endothelial fenestrations in VHL null clear cell renal cell carcinomas as a potent target of anti-angiogenic therapy. (2012)
  • Author(s): Yamasaki T, Kamba T, Kanno T, Inoue T, Shibasaki N, Arakaki R, Yamada T, Kondo K, Kamoto T, Nishiyama H, Ogawa O, Nakamura E.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 103 Pages: 2027-2037
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] JunB promotes cell invasion and angiogenesis in VHL-defective renal cell carcinoma. (2012)
  • Author(s): Kanno T, Kamba T, Yamasaki T, Shibasaki N, Saito R, Terada N, Toda Y, Mikami Y, Inoue T, Kanematsu A, Nishiyama H, Ogawa O, Nakamura E.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 31 Pages: 3098-110
  • Peer Reviewed