2012 Fiscal Year Annual Research Report
Rac活性ポジティブフィードバックループのシナプス構造可塑性維持への関与
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24680036
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
実吉 岳郎 独立行政法人理化学研究所, 記憶メカニズム研究チーム, 研究員 (00556201)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | シナプス可塑性 / アクチン細胞骨格 / Rac / CaMKII / 海馬 / 長期増強現象 |
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| Research Abstract |
本研究計画は、海馬長期増強に伴うシナプス構造可塑性での構造維持の分子メカニズムを理解するため、培養海馬切片を主な材料に分子生物学や薬理学の手法や2光子顕微鏡技術を用いたライブイメージングで解析するものである。
平成24年度はRac活性によるポジティブフィードバックを直接検証するため、ケージドグルタミン酸やPA-RacによるsLTP誘導時のRac活性をFLIM-FRET法で測定を試みた。しかし、Racバイオセンサーの反応性が悪く、持続するRac活性として捕らえることが難しかった。Racバイオセンサーのダイナミックレンジを改良する必要があり、現在作業中である。今後はセンサーの改良を終えた後、阻害剤等を利用したメカニズムについての検討を行う。
また、シナプス構造可塑性に関与するRac活性の上流の探索をshRNAによるノックダウン法を用いて行った。Rac特異的GEF、Tiam1およびKarilin-7をノックダウンするとRacやその下流因子であるPakの酵素活性阻害と同様に構造可塑性への影響が観察された。Tiam1についてはさらに上流と考えられる
CamKIIとの結合を見いだし、FRET-FLIM法を用いて両タンパク質の相互作用の挙動を単一スパインレベルで可視化する事に成功した。さらにTiam1と結合したCaMKIIの酵素活性はカルシウム非依存的な活性を示す事が分かったため、Tiam1-CaMKIIタンパク質複合体がシナプス構造維持を担う分子メカニズムの一つである可能性が考えられる。以上、本年度の成果としてRac自身によるポジティブフィードバックへ至る前のRacシグナルスイッチのオンは同定できたものと考えている。残りの期間でRacによるポジティブフィードバックの存在を証明したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画どおりには進んでいないものの、FRETバイオセンサー以外のパートで予想外の進捗があったため、全体としては順調に進展しているものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定していた研究方針に大幅な変更はないものの、上記のTiam1-CaMKIIタンパク質複合体の生物学的意義を検証する為の実験を予定している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
現在までの達成度でも記述したとおり、本年度は予想外のパートで進捗があり、研究計画と若干異なる実験に時間を割いたため、直接経費の次年度使用助成金が生じた。当該助成金は、次年度助成金と組み合わせ、バイオセンサーの蛍光特性に合わせた蛍光フィルター購入に使用する予定である。それ以外は計画どおり、分子生物学および生化学実験消耗品、学会参加費を予定している。
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