2012 Fiscal Year Annual Research Report
大腸癌の発癌や進展に深く関与しうる長鎖ncRNAの量的・質的な異常の探索
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24680092
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
丸山 玲緒 札幌医科大学, 医学部, 助教 (60607985)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 長鎖ncRNA / ヒストン修飾 / ChIPSeq / 大腸癌 / DNAメチル化 / バイオインフォマティクス |
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| Research Abstract |
まず初めに微量の臨床検体から質の高い再現性のある結果を得るべく、検体からの細胞分離の方法並びに次世代シークエンサー(SOLiD4)を用いたChIPSeq法のプロトコールの各段階を詳細に検討し、最適化を行った。この改良したプロトコールを用いることで、1x10^5個の細胞、1ng程度のChIP-DNAからChIPSeq法を施行し、安定した結果が得られることを確認した。
次に実際に大腸内視鏡検体と癌細胞株の約30検体でピストン修飾(H3K4me3,K27me3)に対するChIPSeq実験を施行し、これらのChIPSeqデータを用いてサンプル間での比較解析を試みた。ヒストンH3K4me3を認める長鎖ncTNAの7～9割はサンプル間で共通していたが、一部検体特異的にK4me3を認める長鎖ncRNAがあり、これらは何らかの病的意義があると考えられた。この解析を元に、大腸癌検体において特異的に活性化している長鎖ncRNAや、DNAメチル化により不活性化されている長鎖ncRNAの候補リストを作成した。
大腸癌検体でDNAメチル化により抑制されている長鎖ncRNAに関しては、更に多くの臨床検体でメチル化のスクリーニングを行い、少なくとも二つの長鎖ncRNAに関しては多くの癌検体でメチル化を認めることを確認した。これらは癌抑制的な機能を有している可能性があり、現在その機能について細胞株を用いた機能的実験を試みている段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の目標である「大腸内視鏡の生検検体を用いたChlPSeq実験のワークフロー構築」はほぼ達成し、現在までにヒストン修飾に対するChIPSeqを約30検体で施行し、安定した結果を得ている。K36me3に対するChIPSeqやRNASeqは施行できていない。また当初の計画通り、インフォマティクスと公共データを用いた統合解析を試みており、癌において特異的に活性化・不活性化している長鎖ncRNA候補を同定することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き検体数を増やしピストンK4me3に対するChIPSeqを施行し、データの蓄積並びにその解析を進めていく。それ以外にもRNASeqや他のヒストン修飾に対するChIPSeqも施行し、その有用性を検証する。得られた知見をより多くの臨床検体を用いて検証する。同定された長鎖ncRNAの機能解析を行うための実験系を構築する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度にChIPSeqを施行した検体数が当初の予定よりも少なく、かつ予定よりも低コストで施行できたため、助成金に一部未使用額が生じた。次年度はその助成金と合わせ、引き続き次世代シークエンサーを稼働させるためのコストに研究費の大部分を使用する。その他、臨床検体での検証実験に必要な各種試薬類の購入に使用する。
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