2012 Fiscal Year Annual Research Report
紫外線感受性症候群責任因子によるRNAポリメラーゼユビキチン化と待避機構の解析
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24681008
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
荻 朋男 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (80508317)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | DNA修復 / 転写と共役したヌクレオチド除去修復 |
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| Research Abstract |
ヒトにおけるヌクレオチド除去修復機構(NER)の先天的欠損は、高発がん性の色素性乾皮症をはじめとする、日光過敏症を伴う種々の疾患の原因となっている。研究代表者らは昨年、転写と共役したNER(TC-NER)の遺伝的欠損性疾患である、紫外線高感受性症候群の新規責任遺伝子としてUVSSAを同定した。本申請研究は、UVSSA遺伝子産物の機能解析を通して、DNA損傷箇所で停止したRNAポリメラーゼのユビキチン化によるバックトラッキング(待避)の分子機構を解明するとともに、TC-NER欠損性疾患のコケイン症候群と紫外線高感受性症候群とで大きく病態が異なる原因を明らかにすることを目的としている。
まず、RNA polIIoユビキチン化のメカニズム解明のため、ユビキチン化に関わる因子を精製/部分精製し、in vitro再構成系を確立しようと試みている。当初、この過程は25年度に実施する予定であったが、タンパク質精製には膨大な時間を要する事から、初年度より取り組む事とした。その結果、UVSSAをはじめ、複数のTC-NER関連因子の精製に成功している。現在も、再構成系構築に向けて順次精製を進めている。
精製と平行して、RNA polIIoをリビングセルで経時的に観察するシステムの確立にも取り組んでいる。現在、蛍光融合polIIoの作成及び安定発現の条件検討を行っている。さらに、polIIoを安定的にユビキチン化するE3ライゲースの探索を実施している他、NER欠損性疾患患者のうち責任遺伝子未知の検体を対象に次世代ゲノム解析法を用いて新規NER関連因子を探査している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitro再構成系を確立するための、TC-NER関連たんぱく質の精製は順調に進んでおり、残りのたんぱく質の精製も十分に可能であると考えられる。また、RNA polIIoを安定にユビキチン化するE3ライゲースの特定に付随して、NERに関与する新規遺伝子探索を行った結果、損傷部位切り出しに関わるERCC1-XPF複合体の異常がDNA修復欠損性疾患合併症を引き起こす事が分かった。
正常細胞、コケイン症候群患者由来細胞、紫外線高感受性症候群患者由来細胞を用いた、FRAP法(fluorescence recovery after photobleaching)によるDNA損傷処理後のDNA鎖上でのRNA polIIoの滞留時間の差異の検討、及び、FRET法(fluorescence resonanceen ergytransfer)によるRNApolIIoとTC-NER開始反応因子群やTFIISとのたんぱく質相互作用ダイナミクス解析についても、現在解析に向けて条件検討を進めているところであり、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNA polIIoユビキチン化の分子メカニズムの詳細解明のため、未精製のTC-NER関連たんぱく質の精製を実施する他、正確な結果を得るためより純度の高いたんぱく質を精製できるよう配慮したいと考えている。関連たんぱく質の精製が終了次第、in vitro再構成系構築に取り組む。
DNA損傷後のRNA polIIoの挙動を明らかにするため、FRAP法およびFRET法実施の条件検討を済ませた後修復時におけるRNA polIIoと他のTC-NER因子との相互作用のタイミングや、ユビキチン化RNA polIIoのバックトラッキング反応、患者細胞におけるDNA損傷後のRNAnolIIoの分解/滞留等を詳細に調査する。
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