2012 Fiscal Year Annual Research Report
DNA損傷の検出と修復の連携システムを担うリン酸化フィイードバック制御の解明
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24687023
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
古谷 寛治 京都大学, 放射線生物研究センター, 講師 (90455204)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | チェックポイント / DNA損傷 / DNA修復 / リン酸化 / Rad9 |
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| Research Abstract |
DNAチェックポイント機構はDNA申請者はこれまで、チェックポイントタンパク質Rad9(クランプ複合体)が、段階的なリン酸化を受ける事で、DNA損傷への結合から解離までが制御されている事を見出して来た。即ち、Rad9の活性をオン(DNA損傷への結合)にすると自動的にオフ(DNA損傷からの解離)の回路も働きだすフィードバック機構が有る事を示してきた。このフィードバック機構が働く事でチェックポイント機構はDNA損傷部位に結合した後、速やかに解離し、DNA損傷部位を修復機構へと受け渡す事が可能となる。
申請者は本研究に置いて、Rad9が受けるリン酸化フィードバック機構を再現する事を目標とし、解析を進めて来た。先ずはRad9複合体(ヘテロ三量体)を精製した。精製Rad9複合体は後述する試験管内アッセイの他に原子間力顕微鏡での観察にも用いた。予想通り尻尾構造が環状構造から突き出た様な構造体が検出され、今後のリン酸化Rad9を用いた解析へと進められそうであった。さらに、Rad9複合体をDNA損傷部位へとロードする複合体Rad17(ヘテロ五量体)を精製した。現在はATPを使ったローディングアッセイを行っており、平衡して精製した二種類のキナーゼ複合体(CDK、DDK共にヘテロ二量体)によりリン酸化反応解析を行っている最中である。
遺伝学的な解析も行っている。ATR-ATRIP複合体はRad9をリン酸化する酵素の一つであり、フィードバック制御の最初のリン酸化を担う酵素である。また自身がチェックポイント発動においても重要な働きをするリン酸化酵素であり、その制御機構の理解は深くチェックポイント発動の理解に繋がる。本研究ではDNA損傷部位に結合出来ないATRIP変異体を取得した。変異ATRIPを発現する細胞はDNA損傷に感受性を示したため、その機能欠損を補完する遺伝子クローンの取得を試みている。これまでに2つのクローンを得ており解析を進めている最中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本来であれば精製Rad9複合体を用い、DNA損傷部位へのローディング反応を完成させておきたかった。ただ、原子間力顕微鏡による解析が軌道にのり、また、遺伝学的スクリーニングによる、チェックポイント制御因子の獲得の目処が付いた点で補完出来ていると思う。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き精製Rad9とRadl7各複合体を用いたローディング反応の完成を目指す。また、原子間力顕微鏡に依る複合体のかたちの解析をリン酸化されたタンパク質を用いながら引き続き行う。また、遺伝子クローンの同定と更なる獲得を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本来は精製タンパク質を検出するための抗体作製の為の費用である。納品が昨年度に間に合わず、25年度にずれ込んだ。
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