リン酸化、脱リン酸化酵素の連係による細胞分裂制御の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24687025
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 持田 悟 熊本大学, 大学院先導機構, 准教授 (60590304)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: リン酸化 / 脱リン酸化酵素

Outline of Annual Research Achievements

前年度に完了できなかったPPase制御遺伝子(cDNA)のクローニングを続けた。前年度の結果からDNA増幅が困難であることがわかっていたため、PCR法の条件（アニーリング温度、鋳型濃度、プライマー配列など）を変えてなんども試みたがやはり増幅は見られなかった。アニーリング温度を下げることによって何らかのDNAが増幅されることはあったが、DNA配列を読んでみると全く別の配列が増幅されていることがわかった。この難しさの原因としては鋳型として使用したcDNAライブラリーが卵母細胞、もしくは未受精卵由来であったために目的遺伝子の発現量（すなわちcDNA量）が少ない時期である可能性が考えられた。そこでカエルの培養細胞であるA6株、XTC株からmRNAを抽出してそれを元にcDNAを合成し、これを鋳型に用いてPCRを行ったがやはり増幅は成功しなかった。ここまでしてもDNAクローニングができなかった理由としては、アフリカツメガエルという実験動物の特性、すなわち多くの場合で株化された個体（純系）を使用していないことが考えられる。細胞周期研究に使用する卵抽出液の場合には一度にできるだけ多くの抽出液を得たいため、希少かつ小型化する傾向にある純系個体は通常使用しない。またアフリカツメガエルが四倍体生物であることもPCR増幅がうまくいかない理由かもしれなかった。データベースに登録されているcDNA配列でも、数多くの多型が見られるのが普通である。このためにプライマー配列がcDNAを作成するために使用した個体のもつ配列と同一とは限らない。今後は人工遺伝子合成などPCRクローニングに頼らない手法をとることでこの問題を回避できると考えている。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。