2013 Fiscal Year Annual Research Report
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24687028
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高岡 勝吉 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (90551044)
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2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 母性因子 / 染色体分配 / ヒストン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの卵生動物では卵母細胞由来の母性因子が受精後の胚発生のパターニングにおいて重要な役割を果たしている。例えば、ショウジョウバエの卵子では母性因子ビコイドのmRNA が胚の前後軸を決めている。これに対し、マウスなどの哺乳類の胚発生では、ホメオスタシス関連因子の報告がある一方で、①胚のパターニングに関係するような母性因子は報告されていないこと、②桑実胚期までにほとんどの卵子由来のタンパクやmRNAは分解することから、哺乳類胚発生のパターニングにおいては母性因子は関係ないと考えられてきた。マウス胚は卵割期を経て、モルラ期のそれぞれの割球の位置情報を元にHippoシグナルが活性化し、胚の内-外のパターニングが起こる。この内-外のパターニングに沿って、胚盤胞期の内部細胞塊(Inner cell mass, ICM)と栄養外胚葉(Troph ectoderm, TE)が細胞分化する)。その後、ICMは胚体部分に、TEは胎盤部分に分化し、内-外のパターニングはその後のマウス胚発生の基盤となる最初の細胞分化に関わる重要なイベントである。
代表者はこれまでに、リン酸化Smad2の免疫染色が受精後からモルラ期まで観察されることから、Smad2が母性因子として発生期に機能しているのではないかという仮説をたてた。
本研究では、Smad2を糸口に、これまでスポットされてこなかった、母性因子による哺乳類胚パターニングのメカニズムを解明することを目的とし、マウス初期発生研究において母性因子という新たな概念を導入する
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
代表者はこれまでに、リン酸化Smad2の免疫染色が受精後からモルラ期まで観察されることから、Smad2が母性因子として発生期に機能しているのではないかという仮説をたてた。この仮説を検証するために、卵子特異的なSmad2のコンディショナルノックアウトを行った。結果、卵子特異的ZP3-Creを用いてSmad2をノックアウトした♀マウス由来の受精卵では着床前胚時期で胚発生を停止していた。交配する♂が野生型であっても、Smad2欠損接合子型であっても表現型は同じであった。これらの結果より、母性Smad2が、その後のマウス胚発生の基盤となる、着床前胚の胚発生に必須であると結論づけた。
本研究の完了により、代表者は胚発生期のパターニングにおける母性因子の役割を世界に先駆けて報告し、長年哺乳類胚発生のパターニングは接合子性の遺伝子発現によって制御されていると考えられてきた定説を覆す。また、初期発生分野において母性因子という新たな概念を打ちたて、新たな分野を切り開くという点で、哺乳類初期発生分野の学術的理解が進む。さらに、本研究で明らかになる母性因子による着床前胚の形成機構について、卵生動物のとる発生ストラテジーと哺乳類胚発生ストラテジーでどのような違いがあるかを比較する。これにより、哺乳類の胚発生がどのように進化してきたかという進化論に関する研究にも新たな展開を与える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、母性因子Smad2がいつどのような機能をしているかを知るために、Smad2マターナルノックアウト胚において、受精卵から胚盤胞までの時期でどこに分子レベルでの異常が出るかをさらに詳しく解析する。まず、ICM-TEのパターニングに関わる既知の因子(Oct3/4, Hippoシグナル関連因子、細胞接着因子等)、Nodalシグナル関連因子(Nodal, Activin, FoxH1等)の免疫染色を行い、Smad2マターナルノックアウト胚と野生型での発現を比較する。特に、ショウジョウバエ胚の前後軸はビコイドmRNAのグラディエント形成が基になっていることより、各割球での染色強度に着目し、タンパク量を定量化する。また、Smad2との関連性を確認するために、すでに所属研究室が所持し、Smad2以外のTGF-βスーパーファミリー関連因子であるNodal, FoxH1のマターナルノックアウトマウスを準備し、解析を行う。
また、卵子由来のSmad2タンパクが受精卵発生のどの時期まで残存しているのか、そして接合子由来のSmad2がいつから発現を開始しているか、を明らかにするために、Smad2の抗体を使った免疫染色を行う。卵母細胞から胚盤胞までの発生時期ごと、母性由来・接合子由来ごとに、得られた染色結果を定量化し、Smad2タンパク量を算出する。また、総合タンパク量だけでなく、リン酸化フォーム、タンパクの局在に関しても定量する。加えて、Smad2発現細胞に蛍光たんぱく質とSmad2の融合タンパク質を発現するようなトランスジェニックマウスを作成し、経時観察することにより、タンパク量だけでなく、Smad2の各割球の挙動も明らかにし、表現型の解析に役立てる。
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| Causes of Carryover |
平成25年度に作製予定だった遺伝子組み換えマウスが、予想外の動物舎の微生物汚染により平成26年度に計画が延びた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成25年度に計上した遺伝子組み換えマウス作製に必要な物品費を平成26年度に計上した。
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