2012 Fiscal Year Annual Research Report
アンキリンによるイオンチャネルの膜上集積機構の解明
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24689012
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20532980)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / アンキリン / 構造機能連関 / 興奮収縮連関 / 軸索起始部 / 跳躍伝導 |
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| Research Abstract |
（全体構想）心臓の拍動や脳の活動は細胞膜の電気的興奮によるものである。その電気活動を統制するイオン輸送膜蛋白質の細胞膜上の局在と機能を制御する分子基盤を明らかにする。
（具体的目標）神経細胞・心筋細胞の電気的興奮性の要である電位依存性イオンチャネルは細胞膜上に裏打ち蛋白であるアンキリンGと結合することで限局・集積して発現する。本研究では、「アンキリンGによりイオンチャネルはどのように集まり、どのように機能するのか？」を、アンキリン-チャネル蛋白質複合体の結晶構造を解析し、細胞機能解析を行うことで明らかにする。
これまでの研究から神経細胞・心筋細胞膜においてアンキリンGはイオン輸送体(Nav、Kv、CNG、Na+/K+ポンプ)と結合し特定の部位に限局させ膜興奮制御に有利に働くことが報告されて来たが、その構造基盤・結合様式は全く明らかにされていない。
本年度は、アンキリン蛋白が、細胞膜へ接着しイオンチャネルが結合するドメインである、アンキリンリピートからなるmembrane binding domainのタンパク質を大腸菌を用いて発現・精製する事に成功した。精製した蛋白質の性質をCDスペクトラム、動的光散乱法を用いて解析した。アンキリンリピートは前半後半と二分割しても発現することを明らかにし、それぞれの結晶を作成することに成功した。アンキリンはアンキリンリピートの前半部分のパルミトイル化を介して細胞膜へ接着するが、そのパルミトイル化が起こる前半部位の結晶構造を高解像度に解析することに成功した。
また、イオンチャネルとの結合を、種々のイオンチャネルの細胞質断片を用いて解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
蛋白質の結晶構造を解析することは、蛋白質の発現、精製、そして結晶化が困難なため、計画通りの進展は一般に難しい。ところが、本研究では、すでに機能ドメインの結晶構造を解析することに成功し、また他のドメインの結晶をすでに得ている。当初の計画以上に進展しており、来年度以降の進展も大いに期待出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、イオンチャネルとアンキリン蛋白との複合体蛋白質の結晶構造解析に取り組む。イオンチャネル断片とアンキリンとの親和性の解析を行なう。心筋細胞や神経細胞に発現させたチャネルとアンキリンの相互作用を明らかにするため、電気生理学的機能解析、組織学的解析を行ない、イオンチャネルが膜上に局在することで機能がどう変わるのかを明らかにする。本年度に解析した結晶構造を基にした、分子動力学的解析を行い、パルミトイル化を介した膜への接着機構、膜への局在を原子レベルで明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
計画に関する諸条件（新たな知見の発見）
平成24年9月までに、ANK-チャネルの構造解析をし、平成25年3月までに、ANK-チャネルの構造決定及び結合解析を行い、研究成果をとりまとめる予定であった。
しかしながら、平成24年9月に、アンキリン（ANK）が脂質修飾を受けチャネル集積の足場を形成するという新たな知見の発見があり、優先的にANK-脂質の構造解析、結合解析を行う必要が生じた。
次年度は、今後は、当初の予定のアンキリンとチャネルの構造解析・結合解析に加えて、アンキリンと脂質の結合解析に取り組む必要性が生じる。結晶構造解析および蛋白質結合解析の専門的手技を有する実験補助員・ポスドクを雇用し、研究体制に厚みを持たせ、新たに加わった解析に取り組む。
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