2012 Fiscal Year Research-status Report

脳組織構築を制御するＲｅｅｌｉｎ―Ｄａｂ１シグナルによる樹状突起形成機構の解明

Research Project

Project/Area Number	24700357
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	本田岳夫慶應義塾大学, 医学部, 助教 (30365225)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	reelin / dab1 / reeler / yotari / 樹状突起
Research Abstract	ReelinとDab1は大脳新皮質の層形成に必須のタンパク質であるが、その生理的な役割についてはほとんど不明のままである。申請者は、Dab1をノックダウンすると樹状突起が低形成になり、樹状突起を辺縁帯に侵入させている細胞の数が減少すること、また、Dab1が核と細胞質を移行出来る核細胞質間シャトリングタンパク質であることを明らかにしたことから、Reelinは樹状突起形成に関わる遺伝子の発現制御をDab1を介して行うという仮説を考えた。樹状突起形成に関与することが知られている候補となる膜タンパク質を、Dab1のノックダウンと同時に発現させた所、樹状突起形成が一部正常化することが示され、このタンパク質がReelin-Dab1シグナルの下流分子である可能性が示唆された。 dab1のノックダウンにより生じる樹状突起の異常を、この候補分子の単純な発現のみでレスキュー出来たことから、reeler（reelin変異マウス）やyotari（dab1変異マウス）ではこの分子のタンパク質量が減少している可能性が考えられた。そこで、reelerの脳を取り出し、Western blot解析により候補タンパク質の発現量を解析した。候補タンパク質のタンパク質量には顕著な差は観察されなかった。また、dab1をノックダウンしたニューロンを免疫染色し、候補分子の発現量の差を観察したが、この場合もタンパク質量には顕著な差は認められなかった。一方、dab1のノックダウンにより生じる樹状突起形成の障害を候補分子がレスキューする際に必要となるドメインを決定するため、候補分子のリガンド結合に必要な細胞外ドメインの一部を欠損させたタンパク質を発現させた所、樹状突起形成の異常がレスキューされなかった。この結果、この候補分子はリガンド結合依存的にdab1ノックダウンによる樹状突起形成をレスキューしていることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 候補分子のタンパク質レベルでの発現変化がreelerやyotariマウスで検出されることを期待していたが、顕著な差が検出出来なかった為。
Strategy for Future Research Activity	脳全体でのタンパク質量変化は観察出来なかったが、細胞表面レベルでの発現量調節の可能性が残されている。そこで、reeler、yotariマウスより、大脳皮質を切り出し、ホモゲナイズ後に細胞膜画分を分画し、候補タンパク質のタンパク質量を比較する。また、reelerおよびyotariマウス由来のニューロンをReelin刺激し、候補分子の細胞表面でのタンパク質量がreelerマウスでは上昇し、yotariマウスでは上昇しないことを確かめる。候補タンパク質の細胞膜表面でのタンパク質量変化が観察されなかった場合、候補タンパク質はDab1の下流に存在すると思われる樹状突起形成・ガイダンスに関わるシグナル伝達経路を、直接あるいは間接的に活性化していると考えられる。これまでにReelin-Dab1シグナルと候補分子の下流で共通に働くと考えられている分子について、その発現・分布・リン酸化状態等がreelerやyotariマウスで変化しているかを検証する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。平成２５年度は、Reelinメディウムの作成を行う為の培養液及び血清を購入する。また、細胞膜画分と細胞質画分を分画する為の試薬を購入する。さらに、樹状突起形成に関与する分子の動態変化を調べる為の抗体等を購入する。