抗体提示型ウイルスベクターを用いた平行線維・登上線維選択的遺伝子導入法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24700394
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 今野 歩 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40509048)
• Keywords: ウイルスベクター / 小脳 / 抗体

Research Abstract

【抗体提示型レンチウイルスベクターの最適化】
この研究項目に対しては前年度までにある程度進捗しており、さらに液体クロマトグラフィーを用いた精製法を確立することが本年度の課題であった。これに関しては、陰イオンクロマトグラフィーカラムHiTrapQ HPを使用することにより、精製可能であったため、容易に実現できた。具体的な方法は以下の通りである。「①HEK293細胞に4種類のプラスミドをco-transfection②翌日、IgG-FreeのFBSを含む培地に培地交換③３日後に培地上清に出てくる抗体提示型ウイルスベクターを超遠心により回収④ウイルスベクターをPBSに懸濁⑤AKTA Primeに取り付けた、HiTrapQ HPカラムにアプライ⑥NaClによるグラジエント溶出により、一本のピークとして、ウイルス画分を得た」
【抗体の作成】
抗体の作成に関しては、前年度に完了している。しかしながら、マウス小脳スライスに対して、作成した抗体を用いた免疫組織染色をしたところ、あまり良好な染色結果が得られなかった。このため、精製が必要であると思われるが、Affinity精製をするための適切なペプチド固定化カラムが販売しておらず、抗体の精製に関しては進捗がみられていない。未精製であっても、感染が成立する可能性はあるので、まずはこれで感染実験を行うこととした。
【実際のマウスでの感染実験】
本年度の後半からマウスへの感染実験を行う予定であったが、ウイルスベクターの投与までは行ったが、感染結果の確認までは現在までのところ至っていない。今後、検討していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

概要に示したとおり、抗体の精製・マウスでの感染実験において、研究の進捗が遅れている。理由としては、平行して研究を進めていた「ウイルスベクターによる脊髄小脳変性症の遺伝子治療の研究」の方が順調に進捗していたため、そちらエフォートの多くを費やしていた。特に、本年度は論文を提出し、その改訂の対応にも追われていたことも大きな理由である。しかし、本論文は受理され、国際誌に掲載済「Konno A et al., Mutant Ataxin-3 with an Abnormally Expanded Polyglutamine Chain Disrupts Dendritic Development and Metabotropic Glutamate Receptor Signaling in Mouse Cerebellar Purkinje Cells. The Cerebellum 2014 Feb;13(1):29-41.」である。

Strategy for Future Research Activity

マウスへの感染実験を特に重点的に実施する。感染実験を行ったマウスに対しては、小脳スライスを作成し、免疫組織染色を行うことにより、特異的な遺伝子導入が起きているかどうかの確認を行う。
一方で、平行して行っていたアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いた研究が、多方面に進捗しつつあるので、AAVを用いた顆粒細胞特異的な遺伝子導入法も、場合に応じて検討していく予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

消耗品費の利用額の誤差の範囲と考えられる。
主に消耗品と学会参加のための旅費に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Mutant ataxin-3 with an abnormally expanded polyglutamine chain disrupts dendritic development and metabotropic glutamate receptor signaling in mouse cerebellar Purkinje cells. (2014)
  • Author(s): Konno A, Shuvaev AN, Miyake N, Miyake K, Iizuka A, Matsuura S, Huda F, Nakamura K, Yanagi S, Shimada T, Hirai H.
  • Journal Title: Cerebellum Volume: 13 Pages: 29-41
  • DOI: 10.1007/s12311-013-0516-5
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Perturbation of mGluR signaling in SCA3 model mice expressing mutant ataxin-3 and the rescue by intravascular administration of AAV9 (2013)
  • Author(s): A. KONNO, A. N. SHUVAEV, S. YANAGI, H. HIRAI
  • Organizer: Neuroscience2013
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center, San Diego, California, USA
  • Year and Date: 20131109-20131113
• [Presentation] Disruption of mGluR signaling in SCA3 model mice expressing mutant ataxin-3 and the partial restoration via intravenous administration of AAV9 (2013)
  • Author(s): A. KONNO, A. N. SHUVAEV, S. YANAGI, H. HIRAI
  • Organizer: 23rd Neuropharmacology Conference
  • Place of Presentation: Sheraton San Diego Hotel and Marina, San Diego, California, USA
  • Year and Date: 20131107-20131108
• [Presentation] DISRUPTION OF METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR SIGNALING AND RESCUE THROUGH INTRAVASCULAR ADMINISTRATION OF AAV9 IN A MOUSE MODEL OF SPINOCEREBELLAR ATAXIA TYPE 3 (2013)
  • Author(s): Ayumu Konno, Anton N. Shuvaev, Noriko Miyake, Koichi Miyake, Shigeru Yanagi, Takashi Shimada, Hirokazu Hirai
  • Organizer: 第19回日本遺伝子治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山コンベンションセンター・岡山県岡山市
  • Year and Date: 20130705-20130705
• [Presentation] Deficient metabotropic glutamate receptor signaling and rescue through intravascular administration of AAV9 in a mouse model of spinocerebellar ataxia type 3 (2013)
  • Author(s): 今野 歩，Anton N Shuvaev，三宅 紀子，三宅 弘一，柳 茂，島田 隆，平井 宏和
  • Organizer: Neuro2013（第36回日本神経科学大会）
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館・京都府京都市
  • Year and Date: 20130620-20130620