2014 Fiscal Year Annual Research Report
超高感度リン酸化定量法の開発：単離平滑筋細胞の生化学的解析を目指して
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24700407
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
竹谷 浩介 旭川医科大学, 医学部, 助教 (20586862)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 平滑筋 / 毛様体筋 / ミオシン / リン酸化定量法 / キナーゼ / ホスファターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平滑筋は広く体に分布し、その収縮・弛緩能を通じて多様な役割を果たしている。平滑筋の収縮・弛緩はモーターたんぱく質であるミオシンをはじめ、種々のタンパク質のリン酸化・脱リン酸化によって調節されていると考えられている。従って、収縮・弛緩の分子機序を解明するためにはこれらのタンパク質のリン酸化・脱リン酸化を定量的に測定することが重要となる。しかし、(特に微小平滑筋において)技術的困難から、現状ではリン酸化状態の変化を相対的に検出する定性分析が主流となっている。本研究では、Phos-tag電気泳動法を用いた高感度リン酸化検出法を開発し、これを用いて微小平滑筋、特に毛様体平滑筋の収縮制御の分子機序を解明することを目指した。
Phos-tag電気泳動法を用いたミオシン軽鎖のリン酸化定量では、用いる抗体を最適化し、シグナル増感剤を使用することでサブピコグラムレベルでの検出が可能となった。他のリン酸化タンパク質においても同様の手法により高感度検出が可能であったが、用いる抗体によってはあまり高感度化できない場合もあった。この手法を用いてウシ毛様体筋におけるミオシンのリン酸化解析を行ったところ、収縮・弛緩の状態によらずミオシンのリン酸化が常に高く、あまり変動しないことが見いだされた。この結果はこれまで一般的に受け入れられてきたミオシンリン酸化依存性の収縮制御機構が、毛様体筋においては副次的なものである可能性を示唆している。ウシ毛様体筋においてはミオシンリン酸化非依存的な制御因子の存在が強く示唆されたが、まだその因子の同定には至っていない。
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