マーモセット未成長卵子への遺伝子導入・卵巣注入によるトランスジェニック卵子の作出

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24700443
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 本橋 秀之 岡山大学, 学内共同利用施設等, 助教 (20554380)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: マーモセット

Outline of Annual Research Achievements

霊長類の卵巣内には大量の未成長卵子が原始卵胞の形で存在するが，生涯の内に排卵まで至る卵子の総数はその一部に過ぎず，大半は成長することなく終わる．これらの未成長卵子を培養および移植等により利用することが可能になれば，霊長類における発生工学に使用する卵子の新たな供給源として期待できる．本研究では霊長類であるコモンマーモセット雌個体から卵巣組織を採取し，原始卵胞由来未成長卵子の体外培養が可能か検討するとともに，レンチウィルスベクターによるマーカー遺伝子の導入が可能か検討した．合わせて未成長卵子保存の目的から，卵巣組織の凍結保存の検討を行った．
卵巣組織を採取後，解離細胞を調製し幹細胞類縁培地にて未成長卵子の体外培養を行った．未成長卵子は最大3週間前後の培養維持が可能であった． CMV−Venus発現カセットを組み込んだレンチウィルスベクターにより遺伝子導入を行ったところ，導入後５−７日で緑色蛍光の発現が認められた．
一部の卵巣組織はガラス化法にて凍結保存し，融解後に損傷度の評価を行った．コメットアッセイによるゲノム損傷度は非凍結，凍結融解の間で有為な差は認められず，凍結保護物質無添加による凍結融解と比較して著しく損傷度は低下した．超微構造観察では成長卵子において小胞体の損傷が観察され，胞状卵胞内卵子の場合は損傷を受けやすいことが明らかとなった（以上，前年度までの主要成果）．
26年度は，昨年度に引き続き，コモン・マーモセットメス個体から卵巣組織を採取し，24-25年度に確立した体外培養法にて，未成長卵母細胞を培養し，LV-CMV-Venusにて遺伝子導入を行い，レシピエントマウス（NOD-SCID）への注入を行い，経時的にin vivo発生を調査した．その結果，遺伝子導入由来の成長卵子は認められなかったものの，GFP陽性の未成長卵子の存在が確認できた．