2012 Fiscal Year Research-status Report

メカニカルストレス負荷時の骨細胞および骨芽細胞分化におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの役割

Research Project

Project/Area Number	24700767
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Kinki University
Principal Investigator	伊藤智広近畿大学, 農学部, 講師 (30435854)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	microRNA / メカニカルストレス / 骨芽細胞 / 骨細胞 / 分化
Research Abstract	今年度、当初使用していたスキャホールドの販売停止に伴い代替品の選択およびメカニカルストレス条件の再設定に時間を割いた。また、滅菌水を用いた静水圧ストレスではコンタミが生じることもあったので、5％CO2ガスと95％空気の混合ガスを用いて加圧する方式に変更を行った。その結果、静気圧システムを使用した際の分化条件を年度末に設定するに至り、現在、この培養条件で処理したマウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞および骨細胞MLO-Y4細胞からトータルRNAを調製する段階に至っている。また、条件設定の研究と並行してMC3T3-E1細胞のBMP-2刺激における骨芽細胞分化に関わるmicroRNA-370の標的分子の同定を進め、FEBS lettersへ報告した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在進行が遅れている原因は以下3点の培養条件変更などが関与している。 ①これまで使用していたスキャホールドが昨年度始めに販売停止となり、代替品を数点入手し、使用するMC3T3-E1細胞の接着能やメカニカルストレス負荷条件を再度検討する必要があった ②静水圧では滅菌水および滅菌容器を使用していてもコンタミが発生する場合があったので、5％CO2ガスと95％空気の混合ガスを用いて加圧（メカニカルストレス負荷）をするシステムへ変更した ③MLO-Y4細胞のMTAに予想以上の日数がかかった
Strategy for Future Research Activity	マウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞および骨細胞MLO-Y4細胞をそれぞれ2MPaのメカニカルストレスを負荷しながら培養し、負荷12時間後のスキャホールドを回収する。スキャホールド内の細胞からtotalRNAを抽出後、3D Gene microRNA arrayに供し、発現変動したmicroRNAを検索する。発現変動profileを確認後、変動したmicroRNAの標的分子検索や変動microRNAに対するantisense-inhibitorやprecursorを細胞に導入することでメカニカルストレス負荷後の分化への影響について検証する。骨細胞においては、骨細胞が分化の指示を担当する細胞と考えられていることからメカニカルストレス負荷後の細胞培養液を採取し、未分化マウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞を採取培地で培養することによる骨芽細胞分化への影響を検証する。また、この培地中へ放出された分化因子がメカニカルストレス負荷後に変動したmicroRNAの標的でないか解析を進める。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	次年度研究費を以下の項目に使用する。 ①メカニカルストレス負荷後のMC3T3-E1細胞およびMLO-Y4細胞から抽出したtotalRNAの3D Gene microRNA array解析 ②発現変動microRNAをTaqManプローブ検出を用いたReal-time PCRによる再確認 ③変動microRNAのantisense-inhibitorまたはprecursor導入細胞の分化への影響確認 ④変動microRNAの標的遺伝子の検索および同定（western blot試薬、標的分子の抗体、Luciferase reporter assay用ベクターの作製）