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2012 Fiscal Year Research-status Report

腫瘍環境下の内皮細胞におけるNFATcによる転写活性化機構

Research Project

Project/Area Number 24700969
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

末弘 淳一  東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任研究員 (80572601)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywords血管内皮細胞 / VEGF / NFATc / ChIP-seq
Research Abstract

腫瘍環境下の内皮細胞におけるNFATcによる転写活性化機構を明らかにすることを目的とし、本年度は①ChIP-seqによる標的遺伝子の網羅的探索、②NFATc配列を含むEgr-3プロモータ依存lacZ発現マウスを用いた個体レベルでの発現解析を行った。
① 臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いてNFATc抗体を用いたChIP-seqを行い、VEGF刺激後1時間で4,119箇所の結合領域を同定した。ChIP-seqから得られたデータをインフォマティックス解析したところ、1) GGAAA配列にNFATcが結合すること、2) NFATc結合領域周囲にC/EBP、CREB結合配列が存在すること、3) NFATcはH3K4me3ヒストンマークと共局在していることを新たに見出した。NFATc標的遺伝子の絞り込みではChIP-seqとマイクロアレイデータを組み合わせて20遺伝子を抽出し、そのなかでCXCR7、RND1に着目して発現・機能解析を行った。プロモータ解析では、CXCR7遺伝子5’-flanking領域(-439/+89)をクローニングしてレポータアッセイを行い、この領域に存在する3か所のNFATc結合配列が誘導に必須であることを見出した。また、内皮機能解析においてVEGF-NFATcシグナルにより誘導されたCXCR7は、特異的リガンドであるSDF-1を介した細胞遊走、血管新生を増強することを明らかにした。さらに、もう一つの標的遺伝子であるRhoGTPase RND1について機能解析を行い、RhoAを介した内皮バリア機能制御に関わることを明らかにした。
② Egr-3プロモータ依存lacZ発現マウスの胎生期においてE10.5以前にプロモータ活性がほぼ見られず、E15以降の血管においてシグナルが確認された。成体においても同様に血管で強い活性が見られ、特に脳、心臓、皮膚において顕著であった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度に予定していた「HUVECを用いたChIP-seq法によるNFATc結合領域の網羅的探索」、「マイクロアレイによるNFATcを介した発現解析」、及び「これらデータを組み合わせたNFATc新規標的遺伝子の探索」について、順調に終えることができた。NFATc標的遺伝子については20遺伝子を同定し、うちケモカイン受容体CXCR7、RhoGTPaseであるRND1について解析を行った。CXCR7についてはSDF-1、VEGF共刺激下の細胞遊走に関わること、RND1についてはRhoAを介した細胞バリア機能に寄与していることを明らかにした。以上は、VEGF-NFATcシグナリングが内皮機能において中心的役割を果たすことを示唆しており、新たな創薬ターゲットを見出していく上での重要な成果である。
「NFATc結合配列を含むEgr-3プロモータ依存lacZ発現マウス」については各種組織でのプロモータ活性を確認でき、当初の予定を遂行することができた。生理的条件において、胎生から成体までの経時的変化を捉え、Egr-3の発現が空間的、時間的にダイナミックに調節されていることが明らかになった。今後の課題として、NFATc活性化と疾患との関わりを明確にしていくため、病的環境下でEgr-3プロモータ活性がどのように変化するかを各種組織で詳細に解析することが挙げられる。
NFATc抗体を用いたプロテオミクスについて、予備的検討として内在性タンパクの免疫沈降を行い、ウェスタンブロッティングによる検出に成功した。一方、タンパク質の収量の問題により質量分析装置を用いたタンパク質複合体解析、リン酸化修飾解析には至らなかった。今後は現状を打開すべく、スケールアップして内在性タンパクの検出を行う一方、現在使用している抗体に依存しない実験系でバックアップとして検討を進めていく必要が出てきた。

Strategy for Future Research Activity

NFATc結合配列を組み込んだlacZ発現トランスジェニックマウスについては各種組織における血管で活性が確認できたことから、病的環境下(炎症刺激や固形腫瘍モデル)で活性の検討を行う予定である。NFATc抗体を用いたプロテオミクスについては予備実験にて内在性タンパクの免疫沈降に成功していたが、タンパク質の収量の問題により質量分析装置による複合体同定には至らなかった。次年度は、1)タンパク質の量をスケールアップし内在性タンパク質のプロテオミクス解析を行うこと、2) FLAG融合NFATc発現系を立ち上げ、強制発現タンパクを用いたプロテオミクス解析を行うこと、3) yeast two hybridシステムによりNFATcと相互作用するタンパク質を絞り込むこと、を並行して進めていく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

相対的に進捗度が低いNFATcのプロテオミクスについて注力していきたい。
質量分析装置によるプロテオミクスにおいては、免疫沈降条件をさらにブラッシュアップしていくことが必要である。また、当初の計画では免疫沈降に使用する抗体の性質に依存する部分が大きいため、代替案としてFLAG融合NFATc強制発現系を確立し、FLAG M2抗体にて複合体要素を絞り込む作業を行う。さらに、yeast two hybridシステムを立ちあげ、NFATcを含むタンパク質複合体の構成要素を検討していく。以上のアッセイを立ち上げるため、前年度からの繰越金を活用し改善を図っていく。

  • Research Products

    (10 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (4 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] The COUP-TFII variant lacking a DNA-binding domain inhibits the activation of the Cyp7a1 promoter through physical interaction with COUP-TFII.2013

    • Author(s)
      Yamazaki T, Suehiro JI, Miyazaki H, Minami T, Kodama T, Miyazono K, Watabe T.
    • Journal Title

      Biochem J.

      Volume: in press Pages: -

    • DOI

      10.1042/BJ20121200

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Inhibition of histone demethylase JMJD1A improves anti-angiogenic therapy and reduces tumor associated macrophages.2013

    • Author(s)
      Osawa T, Tsuchida R, Muramatsu M, Shimamura T, Wang F, Suehiro JI, Kanki Y, Wada Y, Yuasa Y, Aburatani H, Miyano S, Minami T, Kodama T, Shibuya M.
    • Journal Title

      Cancer Res.

      Volume: in press Pages: -

    • DOI

      doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3231

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A.2012

    • Author(s)
      Mimura I, Nangaku M, Kanki Y, Tsutsumi S, Inoue T, Kohro T, Yamamoto S, Fujita T, Shimamura T, Suehiro J, et. al.
    • Journal Title

      Mol Cell Biol.

      Volume: 32(15) Pages: 3018-32

    • DOI

      10.1128/MCB.06643-11

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Genome-wide approaches reveal functional VEGF-NFATc-mediated RND1 induction is necessary for endothelial barrier potential.

    • Author(s)
      Jun-ichi Suehiro, Yasuharu Kanki, Takashi Minami
    • Organizer
      IVBM2012
    • Place of Presentation
      Wiesbaden(Germany)
  • [Presentation] calcineurin-NFATcシグナルがVEGFを介した血管新生と病的な内皮細胞の表現型に寄与する.

    • Author(s)
      末弘 淳一, 南 敬
    • Organizer
      第71回日本癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      札幌
  • [Presentation] Temporal-spatial analysis of Egr-3 promoter activities in hprt locus target-in transgenic mice.

    • Author(s)
      Jun-ichi Suehiro, Takashi Minami.
    • Organizer
      第20回血管生物医学会学術集会
    • Place of Presentation
      徳島
  • [Presentation] The calcineurin/NFATc signaling axis regulates VEGF-mediated angiogenesis and vascular integrity.

    • Author(s)
      末弘 淳一、神吉 康晴、油谷 浩幸、浜窪 隆雄、児玉 龍彦、南 敬
    • Organizer
      第1回生活習慣病の分子細胞病態学研究会
    • Place of Presentation
      東京
  • [Remarks] 東京大学先端科学技術研究センター血管生物学分野

    • URL

      http://www.vb.rcast.u-tokyo.ac.jp/

  • [Remarks] 杏林大学医学部:教員紹介 末弘 淳一

    • URL

      http://www.kyorin-u.ac.jp/univ/faculty/medicine/education/staff/detail/?id=med50010

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 血管内皮細胞の活性化に起因する疾患の治療又は予防剤2013

    • Inventor(s)
      南敬、末弘淳一、神吉康晴
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人東京大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2013-13530
    • Filing Date
      2013-01-28

URL: 

Published: 2014-07-24  

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