2012 Fiscal Year Research-status Report
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24701014
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| Research Institution | Shizuoka Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
中尾 香菜子 静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (30583059)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | CEA / 糖鎖修飾 / 腫瘍マーカー / プロテオーム |
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| Research Abstract |
初年度となる平成24年度は、数種類の臓器由来の培養癌細胞を用いて、CEAの発現・分泌様式、糖鎖修飾部位について検証した。CEAが高発現・分泌していると言われている、大腸癌、胃癌、膵臓癌、甲状腺髄様がん由来の細胞株を選択し、選択した細胞株におけるCEAの遺伝子、たんぱく質レベルでの発現確認を行った。遺伝子レベルでの発現確認は、CEA特異的なprimerによるPCR法により行い、またたんぱく質レベルでの発現確認は、調製した細胞可溶化液に対し、CEA特異的な抗体によるウェスタンブロットおよび質量分析装置を用いたMS/MS解析により行った。得られた結果を基に、CEAを遺伝子・たんぱく質レベルで高発現する細胞株を選択し、CEAにおける糖鎖修飾の多様性の検証を行った。
ウェスタンブロットにより検出されるCEAの分子量の位置が細胞株ごとで異なっており、しかしながら糖鎖修飾切断処理後では、CEAを発現する全ての細胞株で同じ位置(アミノ酸数から計算される理論分子量の位置)に検出された。CEAは由来臓器や細胞株ごとに異なった糖鎖修飾を有することが示唆された。さらに、LC-MS/MS解析により、CEAにおけるN結合型糖鎖修飾予測部位のうち、これまで実験的に証明されていた3箇所に加え、新たに6箇所の同定に成功した。
一方で、消化器癌由来細胞株において新規のCEAスプライスバリアントおよびバリアント由来CEAアイソフォームたんぱく質が存在すること、そしてCEA関連分子の1つが甲状腺髄様がん由来細胞株特異的に発現することを発見した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CEAは広範囲の癌で産生、血中に分泌されているが、全ての癌で産生されているCEAが同じ分子型をとっているとは考えにくい。CEAが多数の糖鎖を有することから、糖鎖修飾にCEAの臓器特異性が見いだせるのではないかとの予測のもと研究をスタートさせた。培養癌細胞株におけるCEAの発現様式の検証、糖鎖修飾部位の同定においては、おおむね計画通り研究が進んでおり、細胞株ごとのCEAの糖鎖修飾部位の比較も行った。一方で培養上清中に分泌されているCEAについてはまだ検証しておらず、次年度は主に培養上清を用いてCEAの糖鎖修飾部位の同定を行っていく予定であり、細胞内でのCEA糖鎖修飾様式との相関をはかる予定である。
しかしながら、CEAの発現を遺伝子レベル、たんぱく質レベルの両方で検証した結果、これまで報告されていない新規のCEAスプライスバリアントおよびスプライスバリアント由来CEAアイソフォームたんぱく質の存在を新たに同定し、さらにCEA関連分子の1つであるCEACAM4が甲状腺髄様がん由来細胞株特異的に発現することを発見した。計画の際には想定していなかった結果ではあるが、CEAの臓器特異性を見出すという最終目標に別の方面からアプローチできる可能性が示唆されたため、その点において当初の計画以上に進展していると言える。
以上のことから、研究の現在の達成度としては、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、①培養上清中のCEAにおける糖鎖修飾部位の同定と細胞内CEAとの比較②前年度同定した新規CEAプロテインアイソフォームの培養上清中への分泌の検証。以上2点について、培養細胞株を用いて検証していく予定である。これらの結果を合わせて、臓器特異的なCEAの定義付けを行っていく予定である。
さらに、ヌードマウスに前述の細胞株を移植し、腫瘍組織中および血中におけるCEAの分子様式についても検証する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の計画では、人件費・謝金分の使用を予定していたが、その分の金額が未使用であったこと、またHPLC分離カラムやプラスチック器具等において、一部予定金額よりも使用が少なかったことで、当該助成金が生じたと考えている。
翌年度の物品請求に関して、前年度に引き続き、細胞培養用試薬、糖鎖切断酵素およびたんぱく質発現解析試薬（主にウェスタンブロットで用いる特異抗体）を請求する予定である。また、LC-MS/MS解析を行う為の前処理用試薬（たんぱく質精製キットや消化酵素等）も随時請求する。次年度消耗品としてヌードマウス（一匹5,000円程度）を請求する。高額であるが、繁殖が困難な上、安定した解析結果を得るためには購入すべきであると考え、請求する。
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