2012 Fiscal Year Research-status Report
マイクロＲＮＡ前駆体の効率的な塩基配列決定手法の開発と配列解析
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24710212
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| Research Institution | Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences |
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Principal Investigator |
川野 光興 新潟薬科大学, 応用生命科学部, 助教 (00455338)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | マイクロRNA前駆体 / 小分子RNA / 機能性RNA / 次世代シーケンス / RNA編集 / 遺伝子発現 / ゲノム / DNA/LNAオリゴ |
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| Research Abstract |
本研究では、次世代シーケンサーを用いて、miRNAの前駆体であるpre-miRNAを効率よく塩基配列決定するための技術開発を行っている。そして、種々の細胞における、pre-miRNA上のRNA編集部位の同定や、新たな(pre-)miRNA発現調節機構の解明などの研究へと展開するための研究基盤を確立することを目指している。
（1）高出現RNAと相補的なDNA/LNAオリゴの設計・合成 ヒト脳細胞（胎児、成人を各一人ずつ）の全RNAサンプルを企業から購入し、それらを用いて約50~90塩基RNAの次世代シーケンス解析を行った。その結果を基に、出現頻度ランクtop100リストを作成した。このリストと塩基配列データを用いて、出現頻度の高いrRNAやsnoRNAに特異的に結合するDNA/LNAオリゴを、プライマー設計ソフトなどを活用して設計した。
（2）小分子RNA (cDNA) ライブラリーの作製およびライブラリー作製プロトコールの改善 新規に設計・合成したDNA/LNAオリゴ（約50種類）を用いて、各ヒト脳細胞の全RNAサンプル由来のcDNAライブラリーを、申請者が開発したプロトコール (Kawano et al. 2010) を用いて作製した。オリゴの濃度や塩基組成を検討することで、pre-miRNA由来cDNAの産生量には影響を与えず、標的RNAに対してのみ機能するオリゴの最適条件を調べた。また、高次構造をとるpre-miRNAを効率よく逆転写反応できる条件検討を行った。
（3）cDNAライブラリーの塩基配列の決定 HiSeq2000次世代シーケンサーを用いて次世代シーケンス解析を行った。
（4）生命情報科学的シーケンスデータ解析 ( Burroughs et al. 2011) の論文で行った一連の次世代シーケンスデータ解析を研究協力者と共同で行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
pre-miRNAのシーケンシングの妨げとなるsnoRNAの割合を、新規にデザインしたDNA/LNAオリゴを用いて大幅に減らすことができた。予想していた通りpre-miRNAの総数を増やすことができ、その中に含まれるRNA編集部位を生命情報学的な解析により順調に解析できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次世代シーケンス解析によって得られた塩基配列データは、生命情報科学解析の専門家と共に解析を行い、新規のRNAや編集部位を見つけることができれば、実験によって検証していく。また、今後この研究を発展させるためにRNA編集解析の研究者と交流を深め、共同研究を進めて行きたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度も引き続き生命情報科学的シーケンスデータ解析を進め、過去のpre-miRNA解析では発見することができなかった新規pre-miRNA候補や、A-to-I RNA編集部位を探索する。さらに、データベース等を用いて各細胞において高発現しているsnoRNA等の情報を入手し、汎用性の高いDNA/LNAオリゴセットを作製する。他のRNAサンプルを用いたpre-miRNAライブラリーの作製およびRNA編集部位の解析も行う予定である。塩基配列解析で得られた結果を、分子生物学的および細胞生物学的手法で検証して成果をまとめ学会等で発表し、研究論文として報告する。
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