2012 Fiscal Year Research-status Report
ｓｉＲＮＡを標的とする蛍光性リガンドの創成と細胞内解析への応用
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24750064
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
佐藤 雄介 東北大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (90583039)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | siRNA / RNAi / 蛍光プローブ / PNA / インターカレーター |
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| Research Abstract |
研究課題であるsiRNAを標的とする蛍光性リガンドの合成とその機能評価を行った。まず、PNAとインターカレーターとを連結したコンジュゲートの合成について、標的siRNA に対応してPNA-アデニンモノマーを選択し、一方でインターカレーターとしては明瞭な発蛍光応答を示すチアゾールオレンジ(TO)を用いて、固相合成法にてコンジュゲートの合成を行った。ここでは、PNA, TO とを連結するアルキルリンカー長を変化させた一連のコンジュゲート群のsiRNA 蛍光応答能を検討することで、リンカー長の最適化を行った。得られたコンジュゲートは、期待した通り、標的siRNA オーバーハング構造に対する選択性が発現し、明瞭な発蛍光応答を示すことを見出した。
上記PNA(アデニン)-TO コンジュゲートを用いて細胞内siRNA解析へと適用した。ここでは、コンジュゲートが細胞透過性に乏しいことから、標的siRNA-コンジュゲート複合体を形成させた後、トランスフェクション剤と混ぜた後、蛍光顕微鏡にて観察を行った。その結果、細胞質にsiRNA に結合したコンジュゲート由来の蛍光が見られ、これはコンジュゲートの発蛍光応答が細胞内siRNA 検出に有用であることを示唆している。さらにこの時、細胞内に導入されたsiRNA がRNAi活性を有していることが確認でき、開発したコンジュゲートを用いることで同一細胞にてsiRNA 動態観察ならびにRNAi活性を評価できる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で提案するPNAとインターカレーターとを連結したコンジュゲートがsiRNAオーバーハング選択性を示すことを見出し、siRNA に特化した蛍光プローブとして有用であることが分かった。加えて、予備検討として行った細胞内siRNA検出においても良好な結果が得られており。本手法に基づいた細胞内siRNA 動的挙動解析へと発展・展開することが可能であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度で得られた蛍光性プローブ開発の結果をもとにして、結合親和性・オーバーハングに対する選択性・結合に伴う発蛍光応答の改良を目指す。ここでは、インターカレーターとしてチアゾ－ルオレンジだけでなく、エチジウムブロマイド誘導体に着目し、よりsiRNA 検出能に優れた蛍光性プローブの開発を図る。また、PNA-インターカレーターコンジュゲートに分子キャップを付与することで、オーバーハング塩基とのスタッキング相互作用を用いることができるため、有用な蛍光性プローブ開発における方法論として期待できる。ここでは、in vitro におけるキャラクタライゼーションに加えて、細胞内siRNA に対する蛍光応答の結果と合わせて考察し、プローブ設計にフィードバックすることで、本系に適した蛍光性プローブへと進化させていく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度使用額は、今年度の研究を遂行したことに伴い発生した未使用額であり、平成２５年度請求額と合わせて、平成２５年度の研究遂行に使用する予定である。
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