2012 Fiscal Year Research-status Report
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24750075
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
小谷 明 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (40318184)
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2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 遺伝子多型 / 電気分析化学 / 変異検出法 / 液体クロマトグラフィー / 大腸癌 |
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| Research Abstract |
大腸癌のテーラーメード医療のために、腫瘍遺伝子であるKRASの変異検出を簡便かつ適切に実施できる分析システムの開発が期待されている。特異的に遺伝子変異を検出できる分子生物学的手法として、リガーゼ検出反応（LDR）がある。LDRで生成する変異部位由来のオリゴヌクレオチド（LDR生成物）の検出にHPLCの適用が図れれば、LDRの汎用性の向上に有利である。本研究では、オリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法を組み込んだHPLCを開発し、変異検出用超高感度分析システムを開発する。
トロロックスの酸化前置波測定に基づく核酸塩基の電気化学検出法の開発を行った。アデニンなどの核酸塩基が共存するトロロックス溶液の電解酸化時のボルタモグラムには酸化前置波が出現し、その波高は核酸塩基の濃度に比例することを見出した。さらに、核酸塩基及びオリゴヌクレオチドが直接電解酸化によって電気化学的に検出できることを明らかにするために、ボロンドープダイヤモンド電極を用いたボルタンメトリーを行った。アデニン由来の明瞭な酸化波は+1.4 Vに観察できた。36、37、44-merのオリゴヌクレオチドに由来する酸化波は+1.4 V～1.5 Vの範囲に出現し、いずれの酸化波も明瞭な波形を示した。これらの電気化学検出法は、HPLCの検出部として利用できることがわかった。
KRAS遺伝子コドン12.2に存在しうる3種類の点突然変異をそれぞれ検出するためのLDR用プライマーを設計した。LDR実施後の試料溶液について変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、G12D、G12A、G12Vの変異部位に由来する43、50、57-merのオリゴヌクレオチドが検出でき、設計したプライマーが正確に変異部位を認識していることが明らかとなった。HPLCで分析するためのLDR生成物の調製方法を確立できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初計画していたオリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法として、トロロックスの酸化前置波測定による方法とボロンドープダイヤモンド電極を用いた直接電解酸化による方法の開発に成功した。さらにKRAS遺伝子コドン12.2に存在しうる3種類の点突然変異をそれぞれ検出するためのLDR用プライマーの設計も成功し、G12D、G12A、G12Vの変異部位に由来するオリゴヌクレオチドをそれぞれ検出できた。
本年度に実施したオリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法の開発とLDR用プライマーの設計は、本研究成功の鍵となる成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) オリゴヌクレオチドの電気化学検出HPLCシステムの開発： トロロックスの酸化前置波測定あるいはボロンドープダイヤモンド電極を用いた直接電解酸化に基づきオリゴヌクレオチドを高感度に検出できる電気化学検出HPLCシステムを構築する。KRAS遺伝子の点突然変異部位に由来するオリゴヌクレオチドの分離分析を行うためのHPLC条件の最適化を行う。
2) 遺伝子変異検出用分析システムの性能評価： KRAS遺伝子の変異検出法としての感度を評価する。すなわち、野生型と変異型のKRAS遺伝子の割合を変えた混液に対して、平成24年度に確立したLDRを実施し、変異部位由来のLDR生成物が本システムにより検出できることを明らかにする。さらに、LDRから電気化学検出HPLCシステムによる測定に至るまで、再現性に関する分析法バリデーションを実施し、遺伝子変異検出用分析システムとしての性能を評価するとともに改良を重ねる。
3) 従来法との比較実験： 従来、LDR法においてオリゴヌクレオチドの検出に用いられるキャピラリーゲル電気泳動法は、感度に優れた分析手法であるが、問題点として光学系の検出部を用いた装置は大型かつ高価、変異場所ごとに蛍光標識プライマーを作製するため高コスト、などが挙げられる。そこで、開発したオリゴヌクレオチドの電気化学検出HPLCシステムがキャピラリーゲル電気泳動法と比較して、実用性、汎用性、動作性について優れ、広範な医療機関への装置導入を考慮したときに有利であること示すために比較実験を実施する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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Research Products
(4 results)
