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2012 Fiscal Year Research-status Report

天然変性タンパク質の相互作用解析による新規分子認識モデルの創成

Research Project

Project/Area Number 24750166
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

長門石 曉  東京大学, 医科学研究所, 助教 (30550248)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2014-03-31
Keywords天然変性蛋白質 / 物理化学解析 / 溶媒和 / 核酸
Research Abstract

当該年度では、human Y-box binding protein (YB-1)の大腸菌発現系からの大量調製を行い、in vitro解析が可能な実験系の構築を行った。また構築した調製・解析系において、既知のターゲット核酸分子との相互作用解析を実施した。
YB-1は核酸結合蛋白質であるため、精製する過程において核酸除去の工程が必須となる。可溶性画分にて発現したYB-1をヌクレアーゼ処理することにより、大腸菌由来の核酸(ゲノムDNAやmRNAなど)を断片化し、YB-1からの解離をしやすくした。ヒスチジンタグを付加しているため、Niアフィニティークロマトグラフィーによるタグ精製を行い、核酸を洗い流し、高効率の除核酸(A260/280 = 0.7程度)を行うことに成功した。続いてイオン交換カラムクロマトグラフィーにて再度精製を行い、夾雑蛋白質の分離を行った。精製後、SDS-PAGEにて目的蛋白質の純度をチェックし、90%以上の高純度で精製できていることを確認した。以上の工程を踏むことにより、YB-1を効率よく大量精製することに成功した。核酸結合蛋白質の精製において、核酸除去と効率的な精製プロセスの重要性が明らかとなり、今後の核酸結合型天然変性蛋白質に対する精製戦略の基盤が構築できた。
調製したYB-1を用いて、既知のターゲット一本鎖DNAに対する結合解析を実施した。等温滴定型熱量測定を用いて、YB-1とDNA間の結合における熱力学的相互作用を評価したところ、YB-1はエンタルピー駆動型の相互作用であることが明らかとなった。一方、相補的な配列であるDNAに対する結合解析を行ったところ、両者では結合親和性の相違が観察された。したがってYB-1には塩基配列選択性が存在することが示され、その定量的解析に初めて成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

YB-1の大量発現、そして精製方法を確立できた。さらに核酸との物理化学的な相互作用解析を行うために、等温滴定型熱量計による解析を実施し、そのパラメータ化にも成功した。以上の成果は、YB-1の分子環境変化における多角的な相互作用解析を遂行する上で重要な基盤となる。

Strategy for Future Research Activity

次年度では、以下のポイントに注視して、YB-1の相互作用メカニズムの解明に挑む。
・DNAとRNAに対する相互作用解析を実施し、その結合メカニズムの相違点を議論する。
・YB-1の機能ドメイン分割した変異体を数種作製し、核酸に対する結合領域の同定とその分子メカニズムを評価する。
・分子環境変化(塩濃度、カチオン種、浸透圧)における相互作用特性を評価し、YB-1の分子認識における溶媒和変化の重要性とその拡張性を精査する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度の研究費使用は以下のような計画を予定している。
消耗品費:オリゴDNAやRNAの多角的な熱力学的解析を行うため、そのサンプル調製のための大量のオリゴ核酸の合成を必要とする(40万円)。また蛋白質の発現調製やその他関連試薬(15万円)、詳細な相互作用解析を主に行っていくためにITCやDSC関連試薬(20万円)、その他バッファー類、分光測定に必要な分光セルなどの消耗品を購入する。
旅費等,その他:研究成果を積極的に発表するために、国内学会への参加する(20万円)。また学術論文への投稿費・英文校閲費(15万円)、文献収集・報告書作成等での印刷費を必要とする。

  • Research Products

    (6 results)

All 2013 2012

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Interaction of water with G-quadruplex loop contributes to the binding energy of G-quadruplex to protein2012

    • Author(s)
      S. Nagatoishi and N. Sugimoto
    • Journal Title

      Mol. BioSyst.

      Volume: 8 Pages: 2766–2770

    • DOI

      10.1039/C2MB25234A

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structural and functional characterization of RecG helicase under dilute and molecular crowding conditions2012

    • Author(s)
      S. Saxena, S. Nagatoishi, D. Miyoshi and N. Sugimoto
    • Journal Title

      J. Nucleic acids

      Volume: 2012 Pages: 392039

    • DOI

      10.1155/2012/392039

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Y-box binding protein 1(YB-1)の物性とDNA結合メカニズムの解析2013

    • Author(s)
      田邊裕美子、長門石曉、西方敬人、杉本直己、津本浩平
    • Organizer
      日本化学会第93春季年会
    • Place of Presentation
      滋賀
    • Year and Date
      20130322-20130325
  • [Presentation] Effects of a thymine residue deletion in TT loops on thrombin-‐TBA recognition interactions: a crystallographic study2012

    • Author(s)
      Irene Russo Krauss, Andrea Pica, Antonello Merlino, Satoru Nagatoishi, Naoki Sugimoto, Lelio Mazzarella and Filomena Sica
    • Organizer
      CONFORMATIONAL DIVERSITY AND APPLICATIONS OF G-QUADRUPLEXES
    • Place of Presentation
      Barcelona (Spain)
    • Year and Date
      20121006-20121008
  • [Presentation] Thermodynamics and hydration effects on the interaction between DNA G-quadruplex and thrombin2012

    • Author(s)
      Satoru Nagatoishi, Naoki Sugimoto
    • Organizer
      The Second Asian Chemical Biology Conference, ACBC2012
    • Place of Presentation
      Okinawa (Japan)
    • Year and Date
      20120704-20120706
  • [Book] 等温滴定型カロリメトリー2012

    • Author(s)
      長門石 曉、津本 浩平
    • Total Pages
      63 (pp645-pp651)
    • Publisher
      ぶんせき (日本分析化学会)

URL: 

Published: 2014-07-24  

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