2012 Fiscal Year Research-status Report
メチル化ＣｐＧに結合するＲＮＡの創出及び高感度メチル化ＣｐＧ検出法の開発
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24760647
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
吉田 亘 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (10599806)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | アプタマー |
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| Research Abstract |
本研究では、メチル化CpGに結合するRNAアプタマーをランダムRNAライブラリーからスクリーニングし、このRNAを用いて標的ゲノム配列中のメチル化CpGを高感度に検出する方法を開発することを目的としている。そこで、本年度はメチル化CpGに結合するRNAアプタマーのスクリーニングを実施した。ビオチン修飾したメチル化CpGをアビジン固定化ビーズに固定化し、そこにランダムRNAライブラリーを添加し、ビーズに結合したRNAのみを回収した。回収したRNAをRT-PCRにより増幅し、RT-PCR産物を鋳型としてT7 RNAポリメラーゼを用いてRNAライブラリーを調製し、次のラウンドのライブラリーとした。本操作を8ラウンド繰り返し、7ラウンド後及び8ラウンド後のライブラリーの配列を解析した。得られた配列の相同性を解析した結果、2つの配列に収束していることが示された。そこで、それら2種類の配列を合成し、メチル化CpGに結合するか蛍光偏光解消法により解析した結果、両配列ともメチル化CpGに結合することが示唆された。しかし、得られたRNA配列は非メチル化CpGに対しても同様に結合することが示唆されたため、メチル化CpGのメチル基を特異的に認識していない可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年度はRNAアプタマーのスクリーニング系を構築し、メチル化CpGに結合するRNAアプタマーのスクリーニングを実施した。その結果、当初の計画通り、メチル化CpGに結合すると考えられるRNAアプタマーを取得することが出来たため、おおむね順調に進展していると考えている。一方、得られたRNAアプタマーは非メチル化CpGにも同様に結合することが示唆されたため、アプタマーの特異性を改良する必要があると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでは、メチル化CpGを標的分子としてRNAアプタマーのスクリーニングを実施したが、得られたRNAアプタマーの特異性に問題があった。そこで、今後はメチル化した二本鎖DNAに対してRNAアプタマーのスクリーニングを実施し、特異的にメチル化DNAを認識するアプタマーを取得することを試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
H24年度はアプタマーのスクリーニングを実施し、メチル化CpGに結合するアプタマーを取得できたが、非メチル化CpGにも結合した。そのため、本アプタマーの詳細な特性解析を実施できなかったため、H24年度の予算の内一部はH25年度に繰り越した。H25年度は繰り越した予算を使いRNAアプタマーのスクリーニングを再度実施する予定である。その後、H25年度分の予算で得られたRNA配列が二本鎖メチル化DNAに結合するか解析するために、SPRチップや蛍光修飾RNAを購入する予定である。また、高感度メチル化DNA検出システムを構築するために、RNAアプタマーにプローブDNAを連結したキメラ核酸を購入する予定である。
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