2012 Fiscal Year Research-status Report
革新的単分子スペックル解析によるアクチン繊維流動の可視化解明
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24770056
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
山城 佐和子 東北大学, 生命科学研究科, 研究支援者 (00624347)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 単分子スペックル法 / 一分子イメージング / アクチン / 細胞運動 / 計測生物学 / 国際情報交換 |
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| Research Abstract |
アクチン繊維は動的に崩壊・再編成され、様々な細胞現象で“骨組み”として働く重要な細胞骨格を構成する。アクチン細胞骨格の動態はこれまで培養細胞内で２次元アクチン単分子スペックル解析により可視化され多くの知見が得られて来た。一方、ほとんどのアクチン細胞骨格は３次元立体構造であり、スペックル解析の３次元空間への発展は必須であるものの、未だ技術的に非常に困難である。本研究では、最も単純なアイデアとして、二焦点分岐光学系により２つの異なる焦点面の画像を同時に取得して、２平面を移動するアクチン繊維の速度と方向性を明らかにすることを目的としている。
平成２４年度の研究で、蛍光標識試薬 DyLight-549 (Thermo Fisher社) で標識したアクチン (DL549-アクチン）を用いた新しいアクチン単分子スペックル顕微鏡法を開発した。新・単分子スペックル法では、ほぼ100％の効率で蛍光アクチンプローブを細胞に導入することが可能になり、単分子イメージングの効率が大幅に改善された。また、DL549-アクチンは細胞内で高い蛍光強度と卓越した褪色耐性を示し、単分子計測の時空間分解能が大幅に改良された。特に、近年開発されたスペックルトラッキングソフトウェア（SpeckleTracker J） を応用することにより、約 8 nm 誤差範囲内でアクチン一分子の細胞内位置決定が可能になった。この解析法により、アクチン繊維流動の速度と方向を高精度に捉えることができるようになった。また、DL549-アクチンに加えて長波長蛍光アクチンプローブ(CF680-アクチン）の開発に成功しており、細胞の自家蛍光の影響を軽減した条件での細胞内一分子イメージングが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、細胞内でアクチン細胞骨格の動態を可視化するため、単分子スペックル解析を行う。単分子スペックル解析は平板な細胞辺縁部構造において細胞骨格のダイナミックな動態の解明に大きく貢献して来た。しかし、単分子スペックルは蛍光が微弱であり、解析には焦点が合った鮮明な画像が必要であるため、厚みのある試料の観察は非常に困難である。これらの問題は共焦点顕微鏡でも蛍光退色や時間分解能に限界があるため解決されず、３次元的に単分子スペックルを解析した例は未だ無い。そこで、本研究では、二焦点分岐光学系を用いて２つの異なる焦点面の画像を一度に取得し、３次元的に移動するアクチンスペックルの方向と速度を明らかにすることを目指している。研究方法のアイデアは単純であるが、既存のGFP-アクチンプローブを用いた単分子スペックル法では以下の問題点が残っていた。(1) GFP-アクチンが主要なアクチン調節タンパク質フォルミンと共働しない。(2) 単分子イメージングに適したGFP-アクチン発現量を持つ細胞を探すことが困難である。（３）緑色蛍光は細胞の自家蛍光の干渉を受ける。私はこれまでの研究で、これらの問題を解決する新・単分子スペックル法を開発した。新手法では、蛍光色素で化学標識したアクチンプローブ (DL549-アクチン）を用いる。DL549-アクチンは、生化学的解析によりフォルミンと共働することを明らかにした。また、細胞内への導入はほぼ100％の効率で行うことが出来る。さらに赤色蛍光及び長波長蛍光色素で標識することで、自家蛍光の干渉を軽減することを可能にした。これらの進展を足がかりとし、３次元単分子スペックル法の開発に向かって順調に前進していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光アクチンを培養上皮細胞に導入し (i) 単分子スペックル法によりラテラル膜でのアクチン繊維流動の速度と方向の解析と (ii) アクチン・ミオシン阻害剤の影響を検証することを目指す。材料は培養上皮細胞（哺乳類 MDCK 細胞と、両生類 A6 細胞) を用いる。上皮細胞ラテラル膜でのアクチン単分子スペックルの追跡は、二焦点分岐光学系装置を設置した蛍光顕微鏡を用いる。アクチン繊維流動の方向性と速度分布を定量化することにより、上皮細胞ラテラル膜近傍でのアクチン繊維流動の動態について、基本的な知見を得ることが出来る。さらに、アクチン阻害剤（サイトカラシンD）及びミオシン阻害剤（ブレビスタチン、BDM）で培養上皮細胞を処理し、アクチン繊維流動への阻害の効果と、細胞膜の変化、微小管の動態、細胞伸長、カドヘリン流動に対する影響を検証する。これらの阻害剤に対する細胞の応答から、アクチン繊維流動と、ラテラル膜近傍で起こる細胞現象との関連を示す手掛かりが得られることが期待できる。アクチン繊維流動が関与する細胞現象が見出された場合は、単分子スペックル解析に加えて、多重蛍光イメージングによる他の分子との挙動の比較、遺伝子導入や遺伝子ノックダウン等の分子生物学・細胞生物学的手法を活用して、アクチン繊維流動がその細胞現象を調節するさらに詳細な分子メカニズムの解明を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度は、蛍光アクチンを培養上皮細胞に導入し (i) 単分子スペックル法によりラテラル膜でのアクチン繊維流動の速度と方向の解析と (ii) アクチン・ミオシン阻害剤の影響を検証することを目指す。上皮細胞ラテラル膜でのアクチン単分子スペックルの追跡は、二焦点分岐光学系装置を設置した蛍光顕微鏡を用いる。さらに、アクチン阻害剤（サイトカラシンD）及びミオシン阻害剤（ブレビスタチン、BDM）で培養上皮細胞を処理し、アクチン繊維流動への阻害の効果と、細胞膜の変化、微小管の動態、細胞伸長、カドヘリン流動に対する影響を検証する。アクチン繊維流動が関与する細胞現象が見出された場合は、単分子スペックル解析に加えて、多重蛍光イメージングによる他の分子との挙動の比較、遺伝子導入や遺伝子ノックダウン等の分子生物学・細胞生物学的手法を活用して、アクチン繊維流動がその細胞現象を調節するさらに詳細な分子メカニズムの解明を目指す。
これらの研究を遂行するため、顕微鏡備品、細胞培養消耗品、実験試薬を購入する目的で研究費を使用する。
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Research Products
(2 results)
