2012 Fiscal Year Research-status Report
オートファジーにおけるＡｔｇ１２－Ａｔｇ５結合体の作用機構の解明
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24770092
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
中戸川 万智子 東京工業大学, フロンティア研究機構, 先進研究員 (90402461)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | オートファジー / ユビキチン様タンパク質 / E2酵素 / E3酵素 / 結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
オートファジーは細胞内の主要な分解システムの一つである。オートファジーでは、細胞質に被分解物を包み込んだ二重膜構造体オートファゴソームが形成され、これが液胞またはリソソームと融合することで中身が分解される。オートファゴソームの形成には２つのユビキチン様タンパク質Atg8とAtg12が必須である。これらはユビキチンと同様の結合反応を経て、Atg8は脂質分子ホスファチジルエタノールアミンと、Atg12はAtg5と結合する。Atg12-Atg5結合体はAtg8結合反応のE3酵素として機能する。しかしながら、その立体構造は典型的なE3酵素とは全く異なっており、Atg12-Atg5がどのようにしてE3酵素として機能するのか全く予想出来なかった。
私は、分子内ジスルフィド結合の形成を指標にして、Atg8結合反応のE2酵素Atg3の活性中心のCysと他のアミノ酸残基間の近接度を調べる方法を確立した。Atg12-Atg5存在下および非存在下で調べた結果、Atg12-Atg5が相互作用することによって、Atg3の活性中心のCysの側鎖の向きが活性に重要な他の残基の方へ変化することを示した。さらに、変異解析とシロイヌナズナAtg3の構造との比較により、Atg12-Atg5非存在下においてAtg3の活性がどのように抑制されているのか、その構造的基盤を明らかにした。
本研究により、E3酵素であるAtg12-Atg5がE2酵素Atg3に構造変化を引き起こし、その活性を上昇させることを示した。E3酵素がE2酵素に構造変化を引き起こすことを示した初めての例である。本研究は２０１３年４月１日発行のNature Structural & Molecular Biologyに掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究では、Atg12-Atg5がAtg3に構造変化を引き起こし、Atg3が活性化することを生化学的な解析によって示した。しかしながら、Atg12-Atg5がAtg3とどのように相互作用しているのかは明らかでない。また、Atg12がユビキチン様タンパク質であるのに加え、Atg5にもユビキチン様フォールド（Ubl）が二つ存在する。これら三つのUblがAtg3の構造変化においてどのように関与するのかを含め、Atg12-Atg5がどのようにしてAtg3に構造変化を引き起こすのかを明らかにするには、Atg12-Atg5とAtg3の複合体の構造解析が必須である。現在、Atg12-Atg5とAtg3をそれぞれ高い精製度で精製することに成功し、Atg12-Atg5とAtg3の複合体の結晶化スクリーニングを行った。いくつかの条件で微結晶が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Atg12-Atg5とAtg3の複合体の結晶化スクリーニングの結果をもとに、条件を設定し直し、より良い結晶化条件を探索する。X線解析に耐え得る結晶が得られたら、X線回折データの収集、位相の決定を行う。適当な結晶が得られなかった場合は、生物種を変える、Atg12-Atg5とAtg3を化学架橋剤で固定化して結晶化を試みる。
得られた結晶構造の情報をもとに、Atg12-Atg5とAtg3の相互作用部位やAtg3の構造変化に重要な残基などについて、生化学的に検証する。複合体の立体構造から、Atg12-Atg5とAtg3の相互作用に関わると予想されるアミノ酸残基に変異を導入し、Atg12-Atg5とAtg3の相互作用にどう影響するかを蛍光相関分光法や等温滴定カロリメータにより調べる。また、Atg3の構造変化を阻害するような変異を導入し、構造変化における残基の重要性について、複合体の立体構造と照らし合わせて検証する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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