2014 Fiscal Year Annual Research Report
分子量１０億にも及ぶクロレラウイルスのＸ線結晶構造解析
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24770097
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
東浦 彰史 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (90598129)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子量が１０億にも及ぶクロレラウイルスのＸ線回折を生じるほどに質の良い結晶の作製を目指した大量調製法を前年度までに確立し、本年度も引き続きクロレラウイルスを恒常的に大量調製することに成功している。より純度の高いウイルス試料調製のために遠心法とフィルターの最適化を行った。より高純度に調製したクロレラウイルスを用い、宇宙航空研究開発機構との共同研究による微小重力環境化での結晶化を行った。巨大ウイルスであるクロレラウイルスの結晶化溶液中での沈降を抑制する効果を期待したが大型の結晶を得るに至らなかった。また、前年度までに明らかになったクロレラウイルス表面のファイバー状構造体が結晶成長を妨げている可能性を考え、各種酵素を用いたファイバー除去を試みたがファイバーを除去することはできなかった。
高純度に精製したクロレラウイルスを用い、XFEL照射実験を米国SLAC国立加速器研究所のLCLSにおいて行い、単粒子からの回折像を観測する事に成功した。溶液中では十分に単粒子として存在しており、結晶化の可能性を示唆する結果であった。
クロレラウイルスの結晶を用いたＸ線回折実験には放射光を用いることが必須であり、強力な放射光による結晶への放射線損傷は無視できない。そこで結晶の凍結が必要になると予想される。結晶をその配向を壊すこと無く凍結するためには、不凍液への置換が必須であるが、その際の環境変化に対してクロレラウイルスの様な巨大な分子から得られる結晶は脆弱である可能性が考えられる。そこで、前年度までに小型のモデル蛋白質を用いた高圧凍結実験を実施してきたが、その適用をウイルスの結晶に拡張した。比較的大型なウイルスであるイネ萎縮ウイルスを用いた高圧凍結実験により、2.4オングストローム分解能のＸ線回折の観測に成功した。これにより巨大分子の結晶に対しても高圧凍結法が有効であることを示唆することができた。
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[Presentation] SPring-8 BL44XU, Beamline Designed for a Structure Analysis of Large Biological Macromolecular Assemblies2015
Author(s)
Akifumi Higashiura, Eiki Yamashita, Masato Yoshimura, Kazuya Hasegawa, Yukito Furukawa, Takashi Kumasaka, Go Ueno, Masaki Yamamoto, Tomitake Tsukihara, Atsushi Nakagawa
Organizer
The 12th International Conference on Synchrotron Radiation Instrumentation
Place of Presentation
Marriott Marquis in Times Square, New York City
Year and Date
2015-07-06 – 2015-07-10
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