2012 Fiscal Year Research-status Report
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24770120
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
笠井 倫志 京都大学, 再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 生物物理 / １分子計測 / Gタンパク質共役型受容体 / ダイマー形成 |
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| Research Abstract |
本研究に先立ち、私は、三量体Gタンパク質共役型受容体、いわゆるGPCRのうち、クラスAと呼ばれるサブファミリーに属するGPCRが、細胞膜上で、１００ミリ秒程度で解離する一時的なダイマーを形成するという、ダイマー・モノマーの動的平衡下にあることを示した。本研究課題では、GPCRダイマー、あるいは、動的なダイマー・モノマー変換の生物学的な意義を検証することを目的とした。そのために、直接の下流シグナル分子である、三量体Gタンパク質のうち、GαサブユニットをGFPでラベルし、代表的なGPCRの一つである、β２アドレナリン受容体と同時に蛍光１分子観察を行い、三量体Gタンパク質のGPCRダイマーへのアフィニティを調べた。その結果、リガンドによる刺激前に、GPCRと３量体Gタンパク質は動的な結合解離を繰り返しており、GPCRのモノマーとダイマーの区別がなく、両者への結合時間は１００ミリ秒のオーダーであることが分かった。
つぎに、GβサブユニットをGFPでラベルし、同様の解析を行ったところ、Gαと同様に、GPCRのモノマーとダイマーの両者にほぼ等しく、約１００ミリ秒のオーダーで動的に結合していることが分かった。
この結果は、従来報告されていたプレカップルモデル、すなわち、GPCRと３量体Gタンパク質が、GPCRを刺激する以前から予め３量体Gタンパク質と結合している、というモデルを一部支持するものであったが、本研究では、さらに、GPCRと３量体Gタンパク質との結合が一過的であること、また、３量体Gタンパク質のGPCRへの結合は、GPCRダイマーとモノマーに影響されないこと、が新たに分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GPCRと３量体Gタンパク質のGαについて、ビデオレートでの２色同時蛍光１分子観察を行い、GPCRダイマーとモノマーのそれぞれ別々に結合時間を決定することができた。同様に、GPCRと３量体Gタンパク質のGβについても同様に、２色同時蛍光１分子観察を行い、GPCRダイマーとモノマーのそれぞれ別々に、結合時間を決定することができた。
アゴニスト添加後に同様の解析を詳細に行ったところ、予備実験の結果とは異なり、GPCRダイマーおよびモノマーと、３量体Gタンパク質Gαサブユニットとの相互作用は、リガンド添加でも大きく変化しなかった。同様に、３量体Gタンパク質Gβとの差もなかった。すなわち、アゴニスト刺激によっても、GPCRと三量体Gタンパク質との相互作用は変化せず、常に動的な結合解離を行いながらシグナルを伝えているらしいことが分かってきた。これらの結果を得ることで、本研究はおおむね順調に進んでいるとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
GPCRダイマーの生物学的な意義を引き続き検討することを、本研究の推進方策の中心課題とする。２つの三量体Gタンパク質が、同時にGPCRダイマーにリクルートし、結合する可能性を検討するために、三量体Gタンパク質のうちの、Gsサブユニットを遺伝的に欠損した細胞株を用いて、GPCRと三量体Gタンパク質Gαサブユニットとの二色同時１分子観察を行う。これは、ほぼすべての培養細胞株には、Gαタンパク質が内在的に発現しているために、こうした細胞にGFPでラベルしたGαタンパク質を発現させても、Gα全体に対するGFPのラベル効率が低く、２つの三量体Gタンパク質が、同時にGPCRダイマーにリクルートしてくるイベントを検出することができないからである。同時に、siRNAなどを用いて、内在性Gαサブユニットの発現を大きく抑制した細胞株も作成するよていである。このようなGα欠損細胞株、あるいは、Gαの発現抑制細胞株を用いて、GPCRとGαタンパク質との同時蛍光１分子観察を行い、GPCRダイマーの、三量体Gタンパク質の結合時間と、結合のストイキオメトリーに注目して、GPCRダイマーの生理学的な機能の解明を目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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