2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24770157
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
日詰 光治 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (10378846)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | DNA複製 / ヌクレオソーム / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物のDNA複製は、染色体上の多数の領域から開始し、その領域は、“複製開始点”と呼ばれる。複製開始点の決定から、複製のライセンシング、開始といった各ステップは、ORCやMCM、GINSといったタンパク質複合体がさらに互いに結合して形成された超タンパク質／DNA複合体によって制御される。このような、多数のタンパク質因子から構成される超複合体の機能を、その構造動態から明らかにするため、原子間力顕微鏡による分子可視化解析と生化学解析を併用した手法により解析を行った。
平成２４年度中に、複製開始点の塩基配列を含むDNA断片に、出芽酵母ヒストンを用いてヌクレオソームを再構成し、そこに複製開始点特異的に結合するタンパク質複合体であるORCを加える実験系を確立し、解析に供した。その結果、ヌクレオソーム形成により、ORCと複製開始点DNAとの結合の、塩基配列特異性が上昇し、結合の安定性も上昇することが見出された。また、ORC結合により、複製開始点付近のヌクレオソーム配位が再編成されることも明らかにした。
更に、平成２５年度には、pre-RC（複製開始点のORCに、さらにMCMなどの複合体が相互作用することにより形成される複合体）の可視化をめざし、試験管内で構築したpre-RC複合体と、酵母細胞から回収したpre-RCの双方の観察を行った。その結果、pre-RCと考えられる楕円形の複合体がDNA上に認められ、さらにそこを起点にDNAがループを形成する傾向が検出された。
平成２６年度には、MCMにCdc45とGINS複合体が結合したCMG複合体の解析に注力した。活性化型DNAヘリカーゼであるCMG複合体を、一端に一本鎖DNA部分をもつDNA基質に結合させたCMG／DNA複合体の観察に成功し、ヘリカーゼとしてDNA上を進行中のCMG複合体の可視化解析を行う基盤技術を確立するに至った。
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