2014 Fiscal Year Annual Research Report
ＤＮＡ合成反応の可視化技術を基としたタンパク質複合体の精密挙動解析
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24770164
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
大重 真彦 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (00451716)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | １分子観察 / 分子計測 / 可視化技術 / DNA / DNAポリメラーゼ / ヌクレアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
流れのON/OFF制御により、RPA-YFP標識ssDNA形態を伸張形態及びランダムコイル形態に制御し、DNA合成反応を直接観察した。ランダムコイル形態のDNA合成反応の場合、一時的に緩衝液を流しDNAの伸張させることで観察した。DNA合成速度は、伸長形態では91 bases/sec、ランダムコイル形態では52 bases/secであった。DNA合成速度の伸長形態はランダムコイル形態に比較し75%速かった。この結果よりDNAの形態がDNA合成酵素反応のDNA合成速度に影響を与えている事が示されたと考える。
T7 Exoは5’-3’の方向へdsDNAを分解する酵素である。T7 Exoを含む緩衝液を一時的に供給したとき、dsDNAの自由端から単調に短くなる様子を確認した。この自由端からのdsDNAの分解反応はT7 Exoを含まない緩衝液を供給してから数分後に停止した。その後、このdsDNAの伸張の長さに変化はなかった。一方、T7 Exoを連続的に供給した場合、DNA分解反応途中で複数以上の反応停止がおこることを確認した。それらの停止以外はdsDNAの自由端から単調に短くなる様子を確認した。DNA分解反応の間に起こった停止はT7 ExoがdsDNAから解離した事を示したと考える。T7 Exo のDNA分解速度とprocessivityにおいて、T7 Exo を一時的に供給したときでは5.7 bases/secと6692 basesまた、T7 Exo を連続的に供給したときにおいて5.2 bases/sec と5072 basesであった。この結果、T7 Exoを一時的に供給したときと連続的に供給したときのDNA分解速度とprocessivityはほとんど同じであった。T7 Exoの供給方法を変化させることによりT7 Exo活性の性質を明らかにする事ができた。
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[Journal Article] Direct Single-Molecule Observations of Local Denaturation of a DNA Double Helix under a Negative Supercoil State.2015
Author(s)
Takahashi S, Motooka S, Usui T, Kawasaki S, Miyata H, Kurita H, Mizuno T, Matsuura S, Mizuno A, Oshige M, Katsura S.
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Journal Title
Analytical Chemistry
Volume: 87
Pages: 3490-3497
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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