2012 Fiscal Year Research-status Report
新規ｓｈＲＮＡライブラリーによる多能性幹細胞のゆらぎの分子機構同定
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24770206
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
堀田 秋津 京都大学, iPS細胞研究所, 助教 (50578002)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | shRNAライブラリー / トランスポゾンベクター |
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| Research Abstract |
本研究の最終目標としては、トランスポゾンベクターを利用した全ゲノム規模shRNAライブラリーを構築し、Nanog発現ゆらぎの分子機構を明らかにすることである。当該年度研究では、shRNAライブラリーの構築と、その抑制機能評価を行った。
まず、市販のレンチウイルスをベースとしたゲノム規模shRNAライブラリーからshRNAの部分だけを切り出し、我々の構築したトランスポゾンベクターへクローニングを行った。クローニングによるバイアスを最小限とするために、PCR増幅は行わず、ライゲーション後の大腸菌培養も、軟寒天培養を用いたコロニー浮遊培養を行った。また、なるべく多くのshRNAをクローニングするため、このクローニングを４回繰り返して行った。
作製したshRNAライブラリーを確認するために、高速シーケンサーMiSeqを用いた解析を行った。MiSeqでDNA断片を解析するためには、ブリッジPCR反応を行うためのアダプターを付加する必要があるが、市販のPCR産物へアダプター付加可能なキット(TruSeq)は、平滑末端にT塩基を付加してアダプターをライゲーションする方式であるため、操作が煩雑である。そこで我々は、２回のPCR反応でアダプター配列を付加する方法を確立し、shRNAの配列解析を行った。その結果、一つのshRNAライブラリー中に少なくとも2万種類以上のshRNAが含まれる事を確認した。これは、私の知る限り、初めてのDNAトランスポゾンベースのゲノム規模shRNAライブラリーである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、shRNAライブラリーの構築についてはほぼ順調に推移している。ライブラリーの調整を４回行い、各ライブラリー産物を高速シーケンサーMiSeqにて確認し、各プレップに数万種類のshRNAが含まれていることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度で構築したトランスポゾンshRNAライブラリーを用いて、実際に細胞でのスクリーニングを行う。細胞へ導入されたshRNAの配列、および目的の表現系を示した細胞に導入されたshRNAの配列に関しても、初年度に開発したMiSeq解析用アダプター付加法が利用可能である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
引き続き、DNAクローニング関連、次世代シーケンサー関連、および細胞培養関連の消耗品が必要である。
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Research Products
(1 results)
