2012 Fiscal Year Research-status Report
ロドコッカス属細菌の芳香族化合物代謝に必須な新規転写制御ネットワークの解明
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24780068
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
笠井 大輔 長岡技術科学大学, 工学部, 助教 (80452085)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | IclR型転写制御因子 / 二成分制御系 / ビフェニル / 2,6-ジヒドロキシ安息香酸 |
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| Research Abstract |
強力PCB分解菌Rhodococcus jostii RHA1株が有する二成分制御タンパク質BphSTがIclR型転写制御因子をコードするtsdRの転写に関与するかを明らかにするために、二成分制御系のレスポンスレギュレーターをコードするbphTを相同組換えにより破壊した。さらにbphSTの高発現株を構築するためのbphST発現プラスミドの作製を行った。現在、得られた破壊株および高発現株を用いたtsdR転写レベルの評価を行っている。
TsdRにより制御される遺伝子を特定するために、相同組換えによりtsdR破壊株を作製し、得られた破壊株と野生株の遺伝子の転写誘導性をDNAマイクロアレイ解析により網羅的に解析した。野生株及びtsdR破壊株をビフェニル存在下で生育させた際の遺伝子転写パターンを解析した結果、tsdR破壊株では、2,6-ジヒドロキシ安息香酸代謝に関与し、TsdRにより負に制御されるtsdBACD遺伝子群の転写が活性化されることが明らかとなった。一方、野生株においてビフェニル存在下でのtsdBACD遺伝子群の転写活性化は観察されなかった。これらの結果に対し、2,6-ジヒドロキシ安息香酸で生育させた際には、tsdR破壊株においてもtsdBACD遺伝子群の有為な転写活性化は認められなかった。以上の結果から、tsdRが無い条件下では、ビフェニルに応答してtsdBACD遺伝子群の転写活性化に関与する未知の転写制御因子が存在することが示唆され、ビフェニル生育に対してtsd遺伝子群が何らかの関与を持つ可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BphSTのtsdR転写レベルへの影響の評価に関しては、bphT破壊株の作製、bphST高発現株の作製、各株のtsdRの転写量の測定、及びtsdRプロモーター領域の特定を当初予定していたが、現在までに破壊株および発現株の作製を行った。現在、転写量の定量解析を行っているため、進展はおおむね順調であると思われる。しかし、tsdRプロモーター領域の特定に関しては、現在プロモーター解析プラスミドを作製中であり、今後早急にプロモーター活性を測定する必要がある。
TsdR制御下の遺伝子の特定に関しては、tsdR破壊株の作製とビフェニル生育時の遺伝子の転写誘導性の評価を目的としており、今回までにおおむね順調に進展していると思われる。しかし、転写誘導性に影響が認められた遺伝子の破壊等を現在行っているため、今後はこれら遺伝子の機能評価を進める必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、BphSTのtsdR転写レベルへの影響を明らかにするために、先ずtsdRのプロモーター領域を特定した後、ヒスチジンタグを付加したbphTを大腸菌で発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、tsdRのプロモーター領域への結合能をゲルシフト解析により明らかにする。また同時にTsdRの機能評価を行うために、ヒスチジンタグを付加した精製TsdRを調製し、tsd遺伝子群プロモーター領域への結合能を調べる。さらにtsd遺伝子群がビフェニルでの生育能に関与するか明らかにするために、各遺伝子の破壊株または発現株を用いたビフェニルでの生育試験とマイクロアレイを用いた遺伝子転写誘導性の網羅的解析を計画している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究遂行のために必要な試薬類、各種チューブ類等の器具類、及びDNAマイクロアレイ解析に使用するDNAアレイとマイクロアレイ関連試薬の購入を行う。また本研究を遂行する上で必要な情報収集及び研究成果発表のための学会参加 (計国内3回) を想定している。また本研究成果の国際的学会誌への投稿に必要な論文投稿料への使用を予定している。
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