2012 Fiscal Year Research-status Report
新規ハロアルキルリン酸加水分解酵素のペリプラズム移行経路とＮ末端修飾意義の解明
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24780096
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
阿部 勝正 長岡技術科学大学, 工学部, 助教 (40509551)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 有機リン化合物 / 加水分解酵素 / シグナルペプチド / ペリプラズム / 難分解性環境汚染物質 / ピログルタミン酸 |
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| Research Abstract |
Sphingomonas sp TDK1から単離に成功した，難分解性含塩素化合物・リン酸トリス（1,3-ジクロロプロピル）（TDCPP）を分解するハロアルキルリン酸加水分解酵素は，これまでに分解報告のない有機リン化合物を基質とするだけでなく，そのペリプラズムへの輸送経路，N末端アミノ酸修飾など，他のバクテリア酵素とは異なる，非常に特異な性質をいくつも有していることが明らかになった．本研究では，これらの中でも特に新規性の高い，ペリプラズム輸送経路とN末端タンパク質修飾の酵素学的・生理的意義を解明することを目的としている．平成24年度は以下の研究業績をあげた．
まず，当該酵素のシグナル配列が本酵素活性にどのような影響を与えるか確認するため，シグナル配列欠損酵素発現系を構築した．大腸菌組換え体の無細胞抽出液を用いてTDCPP分解活性測定を行った結果，シグナル配列を欠損させた発現系において完全に活性が認められなくなった．本結果はサイトゾル内においてフォールディングすることができないタンパク質の特徴を表したものと考えられ，dHAD の推定シグナル配列は Sec 経路によるペリプラズム間隙へのタンパク質輸送を指示している可能性を強く示唆した．
次に，既に構築されているpETシステムによる当該酵素発現大腸菌での細胞分画法を確立し，その局在について酵素活性測定とウエスタンブロットで解析を行なった．その結果，本酵素は細胞質とペリプラズムの両画分でほぼ等量存在することが明らかになった．本結果について，大腸菌での過剰発現がその局在に大きな影響を与えた可能性も考えられるため，次年度以降，発現量の調節可能な発現系を構築し，再度局在に関する検討を行なう．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の大きな目的の一つであるペリプラズム輸送経路に関して，大腸菌を用いた検討ではあるが，Tat経路依存的にペリプラズムに移行する既報の有機リン加水分解酵素と異なる経路で移行している可能性を示した事は大きな成果といえる．
また，当該酵素の局在解析に関しても，明瞭な結果は得られていないものの，当該酵素発現大腸菌における分画条件の最適化や免疫測定法のための抗体作成・最適解析条件も確立することができた．
以上の結果は今後の本研究課題の遂行及び研究成果に大きく寄与するものであり，本研究は概ね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度は，当該酵素のペリプラズム移行経路の解明とシグナル配列の機能解析に関する研究を主に行なってきた．今後については，前年度の研究をさらに発展させると共に当該酵素の成熟体で見いだされたN末端ピログルタミン酸化の意義について解析を行なう．
1. N末端ピログルタミン酸化の意義の解明
N末端修飾の生理的意義を解明するため，N末端ピログルタミン酸化酵素（グルタミニルシクラーゼ）遺伝子の単離とその破壊株の作成を試みる．さらに本修飾が酵素活性に与える影響を解析するためには簡便な酵素精製法の確立が必要となるため，N末端のピログルタミン酸化が起こらない大腸菌におけるHisタグ融合酵素発現系の構築を行なう．得られた破壊株やN末端未修飾酵素を用いた生育特性解析や酵素学的諸特性解析を行なうことで，N末端修飾意義の解明を目指す．
2. ペリプラズム移行経路の解明
前年度の局在解析ではpET システムによる当該酵素の過剰発現がその局在に大きな影響を与えた可能性が考えられた．そこで発現量を調節することが可能なアラビノース誘導型pBadシステムを用いた当該酵素の大腸菌発現系を構築し，前年度確立した条件での細胞分画および局在解析を行なう．また同時に，Sphingomonas sp. TDK1株の細胞分画法の確立と本菌株中における当該酵素の局在解析を試み，野生株での当該酵素の局在を明らかにする．さらに，Tat経路とSec経路で重要な役割を果たすtatC，secA，secYの部分遺伝子の単離とその破壊株の取得し，各種遺伝子破壊株を用いた局在解析を行なうことで本酵素のペリプラズム輸送経路の解明を目指す．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当該助成金が生じた理由としては，会計上の理由で3月末までの支払いが済んでいない分，及び，前年度の遺伝子関連試薬の購入が当初予測より少なかったためである．
本年度に関してはN末端ピログルタミン酸化酵素など多種の未同定遺伝子の単離や遺伝子破壊株の構築など，前年度より多くの分子生物学実験を行なう予定である．また，酵素活性測定でガスクロマトグラフィーを当初の予想以上に使用しているため，その消耗品費が本年度不足する可能性も考えられる．
以上の事から，当該助成金については本年度請求した助成金と合わせて主に分析関係試薬や遺伝子関連試薬などの消耗品費として使用する予定である
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Research Products
(9 results)
