2014 Fiscal Year Annual Research Report
新規ハロアルキルリン酸加水分解酵素のペリプラズム移行経路とＮ末端修飾意義の解明
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24780096
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
阿部 勝正 長岡技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (40509551)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 有機リン化合物 / 加水分解酵素 / シグナルペプチド / ピログルタミン酸 / 難分解性環境汚染物質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Sphingomonas sp. TDK1から単離に成功した難分解性含塩素化合物・リン酸トリス（1,3-ジクロロプロピル）（TDCPP）を分解するハロアルキルリン酸加水分解酵素は，これまでに分解報告のない有機リン化合物を基質とするだけでなく，そのペリプラズムへの輸送経路，N末端アミノ酸修飾など，他のバクテリア酵素とは異なる，非常に特異な性質をいくつも有していることが明らかになった．本研究では，これらの中でも特に新規性の高い，ペリプラズム輸送経路とN末端タンパク質修飾の酵素学的・生理的意義を解明することを目的として，以下の業績をあげた．
1.本酵素のペリプラズム輸送経路の推定を行うため，pET大腸菌発現系，および，発現量を調整可能なpBad大腸菌発現系を構築し，その局在を解析した．その結果，pET発現系において本酵素はペリプラズムとサイトゾルにほぼ等量存在し，pBad発現系では本酵素はサイトゾル画分にのみ局在することが明らかになった．また，本年度は本シグナルペプチドにおいて重要なアミノ酸残基の同定を行い，一般的なsec依存的なシグナルペプチド間で高度に保存されている塩基性アミノ酸残基が酵素活性に重要な役割を果たすことを明らかにした．
2.N末端のピログルタミン酸化が起こらない，大腸菌におけるHisタグ融合酵素発現系を構築した．本年度は本Hisタグ融合酵素の種々の精製条件の検討を行い，溶出イミダゾール濃度や透析バッファー組成を最適化することで，Hisタグ融合酵素が活性を有したままで均一に精製できる事を明らかにした．
3.次世代シークエンサーを用いたTDK1株のドラフトゲノム解析で，タンパク質のペリプラズム輸送で重要な役割を果たすtatABC，secDF，secYEG遺伝子，および，N末端修飾に関わると考えられる推定ピログルタミン酸酸化酵素（グルタミニルシクラーゼ）など，本研究課題で目的としていた全ての遺伝子を同定した．
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